1,3-D-半乳糖基转移酶p.Arg187Cys突变导致形成ABx亚型

目的 既往在中国人群中发现的1,3-D-半乳糖基转移酶p.Arg187Cys突变个体表型为正常B型,本文探究该突变导致AB亚型的可能分子机制.方法 利用免疫血清学方法鉴定一名中国籍个体的血型血清型,PCR方法扩增ABO基因增强子、启动子和所有7个外显子及其侧翼序列,并对扩增产物进行测序分析;采用Chimira软件构建3...     

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C＞T和539G＞C变异导致A2亚型

为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景，发现并鉴定新的ABO等位基因，采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本，PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列，PCR产物经割胶纯化后直接测序，并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明：5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型；进一步研究发现，1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因，另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比，差异在外显子7的467C〉T和539G〉C变异，导致多肽链P156L和R180P的替换。结论：首次发现467C〉T和539G〉C组合的A2等位基因，中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶RNA干扰重组慢病毒的构建与鉴定

背景:研究表明,通过抑制α1,3-半乳糖基转移酶的生成而减少甚至避免供体Gala(1,3)Gal的生成,是渡过器官移植后超急性排斥反应的一条切实可行的方法.目的:构建小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的RNA干扰慢病毒载体,有效沉默小鼠血管内皮细胞的α1,3-半乳糖基转移酶基因表达,以期为有效控制异种移植超急性排斥反应提供稳定的转染细胞载体.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007-05在天津医科大学总医院普外研究所完成.材料:慢病毒载体系统(四质粒)购自Tronolab公司,包装细胞293T细胞株购自中科院上海细胞所.方法:在线软件设计小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因发卡小分子干扰RNA片段.合成的双链DNA片段并将其连接到Tele-sh003/U6.2载体的黏性末端,产生重组质粒Tele-sh003/U6.2-shRNN/α1,3-半乳糖基转移酶.对干扰质粒做测序分析.用磷酸钙法将得到的阳性重组子与慢病毒包装质粒共转化293T细胞,72 h后收集含病毒上清液,超速离心后得到重组慢病毒.用实时定量聚合酶链反应测定病毒滴度.主要观察指标:干扰质粒的测序分析,慢病毒颗粒的包装和滴度测定.结果:小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因小发卡RNA片段被成功克隆进Tele-sh003质粒中,测序结果显示干扰质粒小干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致.所得慢病毒亦为阳性克隆,经定量聚合酶链反应测定病毒滴度为2×108 Tu/mL.结论:成功构建出小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的小发卡RNA慢病毒RNA干扰表达载体,为进一步控制异种移植超急性排斥反应提供了稳定的转染细胞的载体.     

Bel亚型α1,3半乳糖基转移酶新等位基因的鉴定

目的 分析1例罕见B放散型的ABO血型分子背景,鉴定ABO新等位基因.方法 对1例正反定型未能鉴定其ABO血型的捐血者,分别采用ABO基因第6及第7外显子直接序列测定及单倍体克隆测序进行基因分型,以及检测ABO基因CBF/NF-Y微卫星增强子区域.结果 血清学鉴定为Bel的个体中发现了一个突变的B等位基因,该等位基因与B101等位基因相比,差异在nt905位A>G突变.该突变导致α1,3半乳糖基转移酶Asp302gly,定为Bel新基因,Genbank注册号为FJ009674.ABO基因微卫星增强区域序列测定为G/C型.结论 αl,3-D-半乳糖基转移酶基因中nt905A>G突变可能是Bel分子遗传机制之一,第302位氨基酸变异大大影响了糖基转移酶的活性.     

复合型ABO糖基转移酶的分子生物学与酶动力学的研究

在输血医学最基本的AB0血型系统中，存在着为数不少的ABO抗原性减弱的表型。现在已对这些ABO血型弱表达现象的分子基础进行了广泛的研究，从基因和糖基转移酶水平阐明了部分亚型的调控机理。ABO血型中最为特殊是Cis—AB和B（A）。现已知道2者在基因上可以用相同的理论来解释，随着当前临床使用的商品化血型单克隆抗血清的普及，回顾以前的血清学案例，我们可以把这2个血型放在一起研究。Cis-AB和B（A）血型均具有双重复合糖基转移的功能。     

Bel亚型与α1,3半乳糖基转移酶基因G952A多态性关系的研究

目的 研究红细胞ABO血型系统中B放散型的ABO基因分子遗传基础.方法 通过标准血型血清学试验鉴定了3例Bel亚型及15例对照B型样本,采用ABO基因分型PCR序列特异性引物、ABO基因第6及第7外显子PCR产物直接测序及克隆测序等方法进行ABO基因及亚型的定型.结果 在1例血型血清学检测为Bel亚型标本中,发现一个新的B等位基因.该等位基因与B101标准等位基因相比,差异仅在于ABO基因的第7外显子上nt952位G>A突变,导致多肽链Val318Met,定为B放散型(Bel)新基因,GenBank注册号为EF117687.而其余2例Bel型样本及15例对照B型样本含正常标准B基因.结论 首次在ABO基因编码区核苷酸930位后的错义突变中发现并报道了新B等位基因,表明1,3半乳糖基转移酶基因G952A多态性可能是Bel分子遗传机制之一.     

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶p.Trp181Cys突变导致Aw亚型

目的 探讨Aw亚型的血清学特征和分子生物学机制。方法 采用标准血型血清学方法检测先证者及其家系(父亲、母亲、女儿、儿子)ABO血型,利用聚合酶链反应(PCR)特异性序列引物对先证者及其父亲进行ABO基因初步分型,再使用PCR方法扩增ABO基因7个外显子的全部编码序列并进行测序。结果 该家系成员中有2例为Aw亚型,其红细胞含有弱A抗原,血清中含有抗A和抗B,基因型为Aw.new/O01;2例为B亚型;1例为O亚型。ABO血型基因直接测序分析显示先证者及其父亲存在c.467C>T、c.543G>C杂合变异和c.261delG缺失。第7外显子发生543位碱基G>C突变,导致第181位氨基酸由色氨酸被半胱氨酸替换,该突变极其罕见。结论 α-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因第543位G>C突变可能引起酶活性下降,从而导致A抗原表达减弱,该研究进一步证实该突变具备遗传基础,在家系中能够稳定遗传。     

ABO变异型BW.12等位基因的鉴定及序列分析

目的研究ABO基因的α-1,3半乳糖基转移酶基因变异对于B抗原表达的影响。方法在标准血型血清学方法鉴定基础上,应用聚合酶链反应-序列特异性和ABO基因第1—7外显子PCR产物直接测序进行ABO基因分型及序列分析。结果先证者血清学检测为Bw亚型,PCR-SSP结果显示标本基因型为B/O2。直接测序分析发现c.278CT、c.297AG、c.526CG、 c.657CT、c.703AG、c.796CA、c.803GC和c.930GA 8个位点突变。该序列与B.01等位基因序列比对仅在278位发生CT的突变导致多肽链p.Pro93Leu替换。结论α-1,3半乳糖基转移酶基因278位碱基CT突变产生BW.12等位基因。     

α-1,2岩藻糖基转移酶基因35C〉T和682A〉G突变点体外表达的研究

本研究探讨35C〉T和682A〉G突变点对α-1,2岩藻糖基转移酶（FUT1）表达活性的影响。PCR扩增FUT1全长编码序列DNA片段,通过TOPOTA技术连接至表达载体pcDNA3.1/V5-His,获取目的重组质粒。采用脂质体转染方法将重组质粒转染COS-7细胞,经G418筛选培养后,利用流式细胞术分析细胞表面H抗原,实时荧光PCR检测fut1 mRNA表达情况。结果表明：成功获取了35T、682G＋35T和682A＋35C重组质粒。转染2天后H抗原在COS-7细胞膜上表达,第4天达最高峰。与野生型（682A＋35C）转染的细胞相比,第4天重组质粒（682G＋35T）转染细胞H抗原的表达量仅为野生型的13.3%,而重组质粒35T转染细胞为野生型的52.7%。转染后fut1mRNA水平随着时间延长而逐渐递减,在第1天重组质粒（682G＋35T）转染细胞fut1 mRNA水平仅为野生型（682A＋35C）的14%。结论：682A〉G突变明显降低α-1,2岩藻糖基转移酶活性,而35C〉T引起H抗原的表达部分下降。     

双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化

背景：在ABO血型抗原的研究中,绝大多数样本是相同的ABO基因表达出正常的相同的ABH抗原。但有一定数量的样本表现出具有相同分子遗传背景但表达出来的抗原强度却随着家系\个体不同而有所差异,说明了ABO血型中复杂的表达调控机制。分析一类罕见的双重复合型标本的ABO血型血清学与基因背景情况,深入表观遗传学的研究,有利于部分揭示ABO基因表达机制。目的：探讨双重复合型ABO糖基转移酶表达相关的ABO基因启动子CpG岛甲基化水平与ABH抗原表达的关系。方法：6例经血型血清学定为CisAB或B(A)型的标本,进行ABO基因编码区全长序列和启动子序列的测定,采用重亚硫酸盐处理法检测ABO基因启动子CpG岛甲基化程度。结果与结论：6例双重复合 AB 型的标本中,在 B101等位基因基础上存在 nt803C > G 突变的2个CisAB05/B(A)06等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-33(30%)、nt+27(50%)、nt+49(50%)具有甲基化差异;在A101等位基因序列的基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB01等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-26(10%)位置有甲基化差异;在B101等位基因基础上存在nt640A > G突变的2个B(A)04等位基因ABO启动子CpG岛,在nt-33(10%)、nt+16(50%)、nt+57(60%)、nt+59(60%)、nt+68(60%)和nt+74(60%)位有甲基化差异。全部的6例标本ABO基因启动子区域DNA序列无任何突变异常。结果提示在相同的ABO遗传基因背景下,ABO基因启动子CpG岛区域某些位点甲基化可能影响ABH抗原在红细胞膜表面的表达。     

ABx亚型相关的B型糖基转移酶突变p.R180C 的酶动力学研究

目的探讨AB_x亚型相关的B型糖基转移酶(GTB)突变p.R180C的酶动力学特征。方法以本课题组已构建的野生型GTB-pcDNA3.1真核表达载体为基础,采用定点突变试剂盒构建携带GTB突变p.R180C的表达载体突变体,并以DNA直接测序法验证突变质粒的序列;以野生型和突变型表达载体转化人胚肾上皮细胞(293F)做蛋白表达;再将经亲和柱Ni-IDA纯化后的表达蛋白以SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法鉴定;最后采用酶动力学活性检测试剂盒检测酶动力学参数米氏常数(Km)和催化常数(Kcat)。结果 DNA直接测序:成功构建野生型和突变型GTB-pcDNA3.1真核表达载体;SDS-聚丙酰胺凝胶电泳:野生型和突变型GTB蛋白在293F内成功表达并获得纯化;酶动力学检测:p.R180C突变型GTB的Kcat及Km值分别为野生型GTB的1.7%、3.4倍[岩藻糖(H)受体]与25%、5.2倍[二磷酸尿苷半乳糖(UDP-Gal)供体]。结论 GTB突变p.R180C降低了该酶对H受体和UDP-Gal供体的亲和力和其催化速率,尤其是对H受体的催化速率,进而导致了红细胞表面H抗原生成B...     

鬼臼乙叉甙对SHG-44胶质瘤细胞表达β-1,4-半乳糖基转移酶V后粘附相关分子表达的影响

目的 研究人脑星形胶质细胞瘤SHG-44细胞表达(β-1,4-半乳糖基转移酶V(beta-1,4-galactosyltransferase V,β-1,4-GalT V)后对化疗药物敏感性的影响,分析鬼臼乙叉甙(VP16)处理表达β-1,4-半乳糖基转移酶V的SHG-44细胞后其细胞粘附作用相关因子水平的变化。方法 用120μmol／L的VP16处理转染了正义、反义β-1,4-GalT V和空载体的SHG-44细胞24h后,采用western blot检测整合蛋白β1表达变化及局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的蛋白水平和FAK的酪氨酸磷酸化水平。结果 在未经VP16处理的3株SHG-44细胞中,FAK的蛋白水平没有明显改变,而整合蛋白β1的蛋白表达在转正义β-1,4-GalT V的细胞中最高;经VP16处理后,SHG-44细胞中整合蛋白β1的表达水平增高,FAK及其磷酸化水平下降。但整合蛋白β1,FAK及其磷酸化水平随细胞中β-1,4-GalT V表达水平不同而变化。结论 VP16处理对表达不同水平的β-1．4-GalT V的SHG-44胶质瘤细胞的粘附影响有所不同,提示胶质瘤表达β-1,4-GalT V不仅与肿瘤的恶性行为有关,而且与肿瘤的化疗敏感性有关。     

N-糖链合成相关β-1,4半乳糖基转移酶在人星形胶质细胞瘤中的表达

目的分析与N-糖链合成相关β-1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ(β1,4-galactosyltransferaseⅠ、Ⅱ、Ⅴ,β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ)mRNA在正常脑组织和各级人星形胶质细胞瘤的表达变化。方法采用RT-PCR方法,分析β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人星形胶质细胞瘤的表达存在。以扩增的3种同工酶cDNA片段作为探针进行标记,Northernblot分析其mRNA在正常脑组织和各级人星形胶质细胞瘤中的表达变化。结果RT-PCR检测到β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人星形胶质细胞瘤中的表达存在。northernblot发现β-1,4-GalT-Ⅱ、Ⅴ在正常脑组织中有表达,但β-1,4-GalT-Ⅱ的表达较低,而β-1,4-GalT-Ⅰ在正常脑组织中表达极低。β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在星形胶质细胞瘤中的表达显著高于正常脑组织。其中,β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ在各级胶质瘤中的表达没有明显差异。而β-1,4-GalT-Ⅴ的表达随胶质瘤分级的增高而增加。结论N-糖链合成相关的β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人脑星形胶质细胞瘤发生过程中的表达不同,尤其是β-1,4-GalT-Ⅴ的表达与人星型胶质瘤的恶性程度显著相关。     

SHG-44胶质瘤细胞表达β-1，4-半乳糖基转移酶V后对鬼臼乙叉甙敏感性影响

目的：研究鬼臼乙叉甙(Etoposide，VP16)对表达β-1，4-半乳糖基转移酶V(beta-1，4-galactosyltransferase V，β-1，4-GaITV)的SHG-44胶质瘤细胞死亡和凋亡的影响，为进一步探讨β-1，4-GaIT V与化疗药物敏感性的关系奠定基础。方法：通过流式细胞仪(FCM)和Hoeehst 33258染色法，分析不同浓度的VP16处理转染了正义(GalT V-HA／SHG-44)、反义β-1，4-GalT V(GalT V-AS／SHG-44)和空载体(Mock)的SHG-44细胞后细胞的凋亡和死亡情况。结果：①低浓度的VP16(20μmoL／L)处理24h后，GalT V-HA／SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞的比例明显低于Mock组(t=4．5506，P&;lt;0．01)和GalT V-AS／SHG-44组(t=5．0865,P&;lt;0．001)。GalT V-AS／SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞比例明显高于Mock组(t=3．2873，P&;lt;0．01)。高浓度的VP16(120μmoL／L)处理48h和72h后，GalT V-HA／SHG-44组死细胞所占比例明显低于Mock组(t=3．3664，P&;lt;0．05；t=5．4953，P&;lt;0．01)和GalT V-AS／SHG-44组(t=3．1732，P&;lt;0．01：t=4．6035，P&;lt;0．001)。②MTT分析显示，VP16处理48，72h后，GalT V-HA／SHG-44组活细胞数明显高于Mock组(t=5．0783,P&;lt;0．05；t=3．8923,P&;lt;0．01)和GalT V-AS／SHG44组(t=4．5667，P&;lt;0．01；t=4．7849，P&;lt;0．001)。③VP16(20μmoL／L)处理24h后，用Hoechst 33258染色。镜下观察到死亡或者凋亡细胞中的细胞核仁及断裂的核片段呈新月形。或核固缩并深染。GalT V-AS／SH组平均死亡和凋亡阳性率为41％，大大高于经同样处理的转染空载体和转染正义β-1，4-GaIT V的SHG44细胞。结论：β-1，4-GalT V能够影响抗肿瘤药VP16的杀伤作用，过表达β-1，4-GalT V可以拮抗VP16的作用，为解释胶质瘤的化疗耐药性提供了新的依据。     

在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位的研究

目的在大肠杆菌中以可溶性形式表达鼠源性α-1，3-半乳糖基转移酶的催化结构域（α1，3GTcd；catalytic domain of α1，3GT），利用其在人消化道肿瘤细胞表面构建钟α-gal表位（Gah1-3Gal-β1-4GlcNAc-R），拟用来制备一种新的自体肿瘤疫苗。方法利用pET-15b载体以可溶性形式表达鼠源性α1，3GTed，利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性。通过其在人不同消化道肿瘤细胞表面构建钟α-gal表位，先与人血清孵育，FTTC标记的羊抗人的IgG为第二抗体，用流式细胞仪检测荧光强度，以分析钟鲥表位的表达结果。结果可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1，3GTcd并利用HPLC阴离子交换柱检测α1，3GTcd的活性。流式细胞仪检测结果证明了在人消化道肿瘤细胞表面成功构建了即gal表位。结论本研究可溶性的表达了α1，3GTcd，并利用其在人消化道肿瘤细胞表面成功地构建了α-gal表位．为该方法的临床治疗的应用打下坚实的基础。     

鬼臼乙叉甙对SHG-44胶质瘤细胞表达β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅴ后粘附相关分子表达的影响

目的　研究人脑星形胶质细胞瘤SHG 4 4细胞表达 (β 1,4 半乳糖基转移酶Ⅴ (beta 1,4 galactosyltransferaseⅤ ,β 1,4 GalTⅤ )后对化疗药物敏感性的影响 ,分析鬼臼乙叉甙 (VP16 )处理表达 β 1,4 半乳糖基转移酶Ⅴ的SHG 4 4细胞后其细胞粘附作用相关因子水平的变化。方法　用 12 0 μmol/L的VP16处理转染了正义、反义 β 1,4 GalTⅤ和空载体的SHG 4 4细胞 2 4h后 ,采用westernblot检测整合蛋白 β1表达变化及局部粘着斑激酶 (focaladhesionkinase,FAK)的蛋白水平和FAK的酪氨酸磷酸化水平。结果　在未经VP16处理的 3株SHG 4 4细胞中 ,FAK的蛋白水平没有明显改变 ,而整合蛋白 β1的蛋白表达在转正义 β 1,4 GalTⅤ的细胞中最高 ;经VP16处理后 ,SHG 4 4细胞中整合蛋白β1的表达水平增高 ,FAK及其磷酸化水平下降。但整合蛋白β1,FAK及其磷酸化水平随细胞中 β 1,4 GalTⅤ表达水平不同而变化。 结论　VP16处理对表达不同水平的β 1,4 GalT Ⅴ的SHG 4 4胶质瘤细胞的粘附影响有所不同 ,提示胶质瘤表达 β 1,4 GalTⅤ不仅与肿瘤的恶性行为有关 ,而且与肿瘤的化疗敏感性有关。