唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白对肺癌细胞放射敏感性影响的研究

目的 对唇腭裂跨膜蛋白Ⅰ样蛋白(CLPTM1L)的表达与肺癌细胞放射敏感性改变的相关性进行研究.方法 采用噻唑蓝(MTTr)方法和细胞克隆形成实验检测细胞的生长和生存率;采用蛋白质印迹(Western Blot)方法检测蛋白表达水平.结果 不同肺癌细胞的放射敏感性与其细胞中CLPTM1L的蛋白表达水平呈负相关,CLPTM1L高表达的肺癌细胞表现出低放射敏感性;提高肺癌细胞中CLPTM1L的表达水平可明显降低γ射线辐照后细胞的放射敏感性,相反转染CLPTM1L小干扰RNA(siRNA)降低CLPTM1L表达水平则大大提高了肺癌细胞的放射治疗敏感性.结论 CLPTM1L可能是调节肺癌放射治疗敏感性的一种新靶向基因.     

TIPE2 抑制AP-1 蛋白增加人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975 化疗敏感性的机制研究

目的:探讨TIPE2 增强非小细胞肺癌细胞系NCl-H1975 化疗敏感性及其机制。方法:非小细胞肺癌系NCI-H1975 转入TIPE2 慢病毒载体后,加入CDDP 后使用CCK-8 测量IC50 值,凋亡细胞用AnnexinV/ FITC 和PI 凋亡检测试剂盒进行检测,Western blot 检测转染TIPE2 后AP-1 及MDR-1 的蛋白表达量,实时荧光定量PCR 检测转染TIPE2 后IL-1、IL-6 及TNF-αmRNA 水平。结果:(1)TIPE2 降低非小细胞肺癌系NCI-H1975 细胞IC50 值(P<0.001);(2)TIPE2 增加非小细胞肺癌系NCI-H1975 细胞对CDDP 的凋亡率(P<0.05);(3) TIPE2 可显著降低非小细胞肺癌系NCI-H1975 细胞中AP-1 及MDR1 的表达量;(4)TIPE2 可显著降低非小细胞肺癌系NCI-H1975 细胞中IL-1、IL-6 及TNF-αmRNA 水平的表达(P<0.01)。结论:TIPE2 可能通过抑制AP-1 蛋白增加非小细胞肺癌细胞系NCl-H1975 对CDDP 的化疗敏感性。     

微波辐射提高TUNEL法敏感性的实验研究

细胞凋亡（apoptosis）在机体生理、病理过程中的特殊作用使得这一领域的研究成为近年的热门课题［1，2］，而与凋亡相关的检测技术也迅速发展，特别是基于DNA片断末端标记技术的TUNEL法得到广泛应用井试剂盒化。但近年的一些研究显示，TUNEL法用于陈旧蜡块或酸性福尔马林液固定的蜡块时，其阳性检出率明显偏低［3，4］，一些HE染色具有凋亡特征的细胞不能被着色。本研究采用微波辐射处理组织切片，以期提高TUNEL法的敏感性。1材料和方法1．1病例选择选择归档3年以上的陈旧蜡块15例（均为用自来水稀释的10％酸性福尔马林液固定的组…     

miR-145过表达对宫颈癌细胞辐射敏感性的影响

目的:探讨微小RNA(miR)-145过表达增强宫颈癌细胞放疗敏感性的分子机制。方法:运用Lipofectamine 2000将miR-145-mimic转染4株宫颈癌细胞系He La、Ca Ski、C33A和Si Ha,以NC-mimic为阴性对照,并以real-time PCR检测子宫内膜基质细胞(ESC)和4株宫颈癌细胞中miR-145的表达水平;转染的细胞经电离辐射照射后于不同时点运用MTT法和Annexin V-FITC/PI染色法联合流式细胞术分别测定细胞活力和细胞凋亡率;运用免疫荧光检测组蛋白γH2AX的表达水平;Western blot检测细胞中螺旋酶样转录因子(HLTF)的蛋白表达水平。结果:miR-145在ESC中高表达,而在4株宫颈癌细胞中均呈低表达,转染miR-145-mimic后4株宫项癌细胞中miR-145的表达水平显著高于NC-mimic组细胞(P0.05)。相同条件下,辐照后miR-145过表达的宫颈癌细胞的活力显著低于NC-mimic组细胞,72 h的细胞凋亡率明显增加(P0.05)。免疫荧光观察结果显示miR-145过表达显著促进电离辐射诱导的γH2AX激活;Western blot结果显示,miR-145过表达显著抑制HLTF的表达,与NC-mimic比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:miR-145在正常子宫内膜上皮细胞中高表达,而在宫颈癌细胞系中低表达;miR-145过表达可显著抑制宫颈癌细胞的活力,促进电离辐射诱导的细胞凋亡。miR-145过表达增强宫颈癌细胞的辐射敏感性,其机制可能与下调HLTF表达、抑制DNA损伤修复、促进细胞凋亡有关。     

Notch1信号抑制对成骨肉瘤细胞化疗药物敏感性的影响

目的研究抑制Notch1信号对成骨肉瘤细胞化疗药物敏感性的影响及部分机制。方法将人成骨肉瘤细胞系OS-732按γ-分泌酶抑制剂（GSI）作用与否分为GSI组和对照组;脂质体法转染真核细胞表达质粒;Realtime PCR检测NICD、Hes1mRNA表达;流式细胞仪（FACS）检测Annexin V-PE/7-AAD双标的细胞凋亡;MTT法检测化疗药物对细胞的抑制率。结果 GSI组NICD和Hes1 mRNA均较对照组明显降低（P〈0.01）。GSI组化疗药物导致的瘤细胞抑制率和凋亡率均明显高于对照组。过表达Hes1可减弱GSI诱导的瘤细胞化疗药物敏感性增高。结论 GSI通过抑制Notch1受体激活和下游靶基因Hes1表达促进人成骨肉瘤细胞凋亡,从而增加人成骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

凋亡抑制蛋白与细胞凋亡调控

Ｃａｓｐａｓｅｓ蛋白酶激活级联反应在凋亡调控中起核心作用,它主要涉及两条途径：死亡受体介导途径与线粒体依赖途径。不同的凋亡刺激信号经各自特定的途径起始不同的ｃａｓｐａｓｅｓ级联反应,进而激活下游的效应ｃａｓｐａｓｅｓ,诱发细胞凋亡。正常情况下细胞凋亡受到严密的调控以防因失调而导致机体病变。     

肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）诱导肺癌细胞凋亡的研究

目的　研究肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）对肺癌细胞株（A549）的致凋亡作用及其作用机理,为临床应用TIL治疗肺癌提供依据.方法　从肺癌病人胸水中用淋巴细胞分离液分离提取出TIL细胞,在含1000U/mlIL-2的完全培养基中培养20天后,将TIL细胞与靶细胞（肺癌细胞株）共同培养24小时,将培养细胞制成细胞涂片,经福尔马林固定,用原位末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的脱氧三磷酸嘧啶（duTP）末端标记法（TUNEL）原位的方法进行肺癌凋亡细胞的标记.结果　肺癌肿瘤细胞凋亡指数（%）经TIL作用组的凋亡指数为8.56±0.84,对照组凋亡指数为2.10±0.86,两组之间差别有非常显著性（p<0.01）.结论　TIL细胞诱导肺癌细胞的凋亡可能是TIL细胞对肺癌细胞杀伤作用的机理之一.     

肺癌细胞相关蛋白分子N35的实验研究

目的分析肺癌相关蛋白N35的有关特性 ,探讨其潜在的临床应用价值。方法以抗人肺癌mAbN 35作为免疫探针 ,用免疫沉淀和免疫印迹法 ,测定其相关抗原在肺癌组织、肺癌细胞系GLC 82 ,宫颈癌细胞系HeLa ,肝癌细胞系HepG 2 ,乳腺癌细胞系PMC ,正常人心脏及肺组织的存在与分布情况 ;用N 聚糖酶酶解方法确定肺癌相关蛋白N35与糖蛋白分子的关系 ;用差速离心技术分离出肺腺癌细胞系GLC 82亚细胞结构中的胞膜、胞核及线粒体成分 ,经免疫印迹法测定相关蛋白N35在亚细胞结构中的分布状况 ;用免疫荧光技术检测肺癌相关蛋白N35在肿瘤细胞有丝分裂过程中的功能结构定位。结果肺癌相关蛋白N35是一种糖蛋白分子 ,不存在于正常人心脏及肺组织蛋白组分中 ,而是以不同分子质量的形式分布于GLC 82 ,HeLa,HepG 2和PMC细胞蛋白中 ;在亚细胞结构中主要分布于胞核 ,线粒体次之 ,胞膜上分布最少 ,不支持其以膜蛋白或跨膜蛋白的形式存在 ;在肿瘤细胞有丝分裂进入S至G2 期时 ,明确地定位于中心粒(centriole)结构上 ,提示其功能可能与肿瘤细胞的无限制增殖有关。结论肺癌相关蛋白N35是一种只存在于肿瘤细胞并与其无限增殖密切相关的蛋白分子 ,有可能具有调节肿瘤细胞生长的作用。     

ATRA联合Genistein对肺癌细胞凋亡及ICAM-1表达的影响

目的 探讨ATRA联合Genistein对A549细胞凋亡及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法采用ATRA、Genistein单药及两者联合处理人肺腺癌细胞株A549,观察A549细胞生长情况并采用MTT法检测A549细胞的增殖抑制率,运用TUNEL法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞表面ICAM-1的表达。结果A549肺癌细胞经ATRA、Genistein及两者联合处理后,细胞增殖明显受抑制,凋亡指数明显提高,ICAM-1表达明显下调;其中以两者联合用药最为显著。结论ATRA联合Genistein能协同抑制A549细胞的增殖、促进细胞的凋亡,并可能下调ICAM-1的表达,进而降低肺癌细胞转移的潜能。     

非小细胞肺癌中窖蛋白1和pERK1/2表达与预后相关性研究

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织窖蛋白1与pERK1/2的表达及其与预后的关系.方法 应用免疫组织化学(sP法)检测160例NSCLC及20例正常肺组织标本中窖蛋白1与pERK1/2的表达.结果 窖蛋白1在NSCLC和正常肺组织阳性率分别为65.6%(105/160)和100%(20120),P=0.002.中-高分化组和低分化组阳性率分别为56.8%(46/81)和75.7%(53/70),P=0.015;Ⅰ-Ⅱ期阳性率为58.2%(53/91),Ⅲ-Ⅳ期阳性率75.4%(52/69),P=0.024;有淋巴结转移组阳性率为77.8%(56/72),无淋巴结转移组阳性率为55.7%(49/88),P=0.003.窖蛋白1阳性患者1、3、5年生存率(71.4%、37.1%、17.1%)低于阴性患者(89.1%、69.1%、43.6%),P=0.000.pERK1/2在NSCLC和正常肺组织阳性率分别为61.3%和0,P=0.000;中-高分化组和低分化组阳性率分别为53.1%(43/81)和71.4%(50/70),P=0.021;Ⅰ-Ⅱ期阳性率为49.5%(45/91),Ⅲ-Ⅳ期阳性率76.8%(53/69),P=0.000;有淋巴结转移组阳性率为80.6%(58/72),无淋巴结转移组阳性率为45.5%(40/88),P=0.000.pEBK1/2阳性患者1、3、5年生存率(74.5%、42.9%、19.4%)低于阴性者(82.3%、56.5%、37.1%),P=0.002.窖蛋白1与pERK1/2负相关,P=0.000.结论 窖蛋白1在NSCLC中低表达,pEBK1/2在NSCLC中高表达.窖蛋白1蛋白阳性表达和pEBK1/2蛋白高表达与NSCLC的发生及侵袭、转移相关.窖蛋白1和pERK1/2可作为NSCLC一个预后预测的指标.     

横纹肌肉瘤中凋亡抑制蛋白c-IAP1、c-IAP2和survivin的表达及意义

目的探讨横纹肌肉瘤(RMS)中凋亡抑制蛋白c-IAP1、c-IAP2和survivin表达与临床病理特点的关系.方法采用免疫组织化学技术(S-P法)和图像分析技术检测43例横纹肌肉瘤及15例正常横纹肌组织中c-IAP1、c-IAP2和survivin表达水平,并结合临床病理特征进行分析.结果 c-IAP1和c-IAP2在RMS中均有表达,RMS中c-IAP1和c-IAP2表达水平高于正常横纹肌组织(P<0.05).survivin在86%(37/43)的RMS中表达,且表达水平高于正常横纹肌组织(P<0.05).c-IAP1、c-IAP2和survivin在胚胎性横纹肌肉瘤(ERMS)和腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)中的表达水平差异无显著性( P＞0.05),但c-IAP2和survivin的表达水平在不同分化程度的RMS之间差异有显著性(P<0.05).有复发/转移的RMS与无复发/转移的RMS相比,c-IAP1、c-IAP2和survivin表达较高 (P<0.05).结论 c-IAPs和survivin在RMS中的表达水平增加;c-IAP2和survivin的表达与横纹肌肉瘤细胞分化有关.c-IAP1、c-IAP2和survivin的高表达可能作为横纹肌肉瘤病人预后不良的标志.     

CIK细胞对乳腺癌细胞株ZK-75-1的杀伤作用及其机制

目的研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cyto-kine-inducedkillingcells,CIK)对乳腺癌细胞株ZK-75-1的杀伤作用,并探讨其作用机制。方法通过HE染色观察凋亡细胞ZK-75-1的形态学改变。应用TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)法检测CIK细胞的凋亡。通过免疫细胞化学染色法检测ZK-75-1细胞中p53、p16、C-myc、Bcl-2及Bax的表达率。结果HE染色显示,CIK细胞向ZK-75-1细胞靠近,形成典型的玫瑰花环状;肿瘤细胞的胞浆中出现颗粒状物,有的肿瘤细胞只见颗粒状碎片;而作为对照的乳腺癌细胞生长良好。TUNEL法检测显示,对照组细胞未染色或染呈均匀的淡蓝色;实验组凋亡的细胞缩小,核或核周染呈深蓝色。CIK细胞作用4~12hZK-75-1细胞的凋亡率上升,作用12~24h细胞的凋亡率下降,与对照组相比较有统计学意义(P<0.01)。免疫细胞化学染色的结果表明,CIK细胞实验组p53、p16、C-myc及Bcl-2蛋白随作用时间的延长均下降,Bax蛋白的表达上调,与对照组相比较均有统计学意义(P<0.01)。结论CIK细胞对乳腺癌细胞ZK-75-1杀伤作用的机制之一,可能与p53、p16、C-myc、Bcl-2蛋白表达的下调及Bax蛋白表达的上调有关,并与CIK细胞作用的时间关系密切。     

PD-1单克隆抗体瘤内用药对小鼠肺癌疗效的影响

目的探索PD-1单克隆抗体瘤内用药对小鼠肺癌的治疗作用,旨在寻找更安全、有效的免疫治疗方案。方法将皮下荷瘤成功的C57BL/6J肺癌小鼠随机分为5组:尾静脉注射生理盐水组(intravenous injection,IV)、瘤内注射生理盐水组(intratumoral injection,IT)、尾静脉注射PD-1单抗组(IV 10 mg/kg)、瘤内注射PD-1单抗组(IT 10 mg/kg)、瘤内注射PD-1单抗剂量减半组(IT 5 mg/kg),分析各组小鼠的生存率和小鼠荷瘤生长情况;运用流式细胞术分析CD8⁺T细胞/CD4⁺T细胞比例,使用免疫组织化学分析各组小鼠荷瘤组织CD45、Ki67的表达,并对上述数据进行统计学分析。结果瘤内注射PD-1单抗可显著抑制小鼠肺癌组织的生长、延长小鼠生存时间,且瘤内组织Ki67表达下调,CD45表达、CD8⁺T细胞/CD4⁺T细胞免疫细胞比例增加。结论瘤内注射组小鼠荷瘤组织生长速度明显受抑、肿瘤细胞增殖指数和生存时间显著降低,提示瘤内注射PD-1单抗对小鼠肺癌的发展进程具有抑制作用,此创新式的治疗方法将为临床治疗肿瘤提供新的思路和策略。     

Subcellular expression of c-IAP1 and c-IAP2 in colorectal cancers: relationships with clinicopathological features and prognosis

The Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP) family includes several critical cell death inhibitors, the expression of which could be involved in colorectal carcinogenesis. Among them, c-IAP1 and c-IAP2 expression has never been investigated in colorectal cancer. The present study was designed to determine whether expression of both IAPs was related to pathological parameters and survival in sporadic colon carcinomas. Analysis of five human colon cancer cell lines by both western blotting of cell fractions and immunocytochemistry showed that the two IAPs could be expressed both in the nucleus and in the cytoplasm. Immunohistochemical analysis of a series of 46 sporadic colorectal adenocarcinomas demonstrated that c-IAP1 expression was more frequent in the nucleus (85%), and that c-IAP2 was more often expressed in the cytoplasm (82%). A significant association was identified between a strong lymphoid infiltrate in the stroma and the nuclear expression of c-IAP2 (p = 0.02). No other relationship was observed between IAP expression and pathological features. After adjusting by age and stage, the relative risk of death was lower for cytoplasmic c-IAP1, cytoplasmic c-IAP2, and nuclear c-IAP2 expression. It was higher for nuclear c-IAP1 expression. These associations were not statistically significant, but this work underlines the importance of taking into account the subcellular location of the IAP family members in the evaluation of their prognostic significance.     

DC-CIK细胞联合替吉奥治疗非小细胞肺癌的疗效观察

目的 观察树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)联合替吉奥治疗非小细胞肺癌的临床疗效.方法 76例非小细胞肺癌(NSCLC)患者随机分为两组(n=38),对照组单用替吉奥治疗,观察组在对照组治疗的基础上加以DC-CIK细胞治疗.采集观察组患者的外周静脉血进行DC细胞培养和CIK细胞培养.于治疗前与治疗7d后用流式细胞仪检测两组患者外周血中CD4+/CD8+、CD44+NK细胞的表达情况, 以及检测两组患者的白细胞数、血小板数,并观察两组患者的非小细胞肺癌症状.结果 观察组治疗后的外周血中CD4+/CD8+、CD4圾NK细胞百分比分别为(1.65±1.03)、(34.56±8.90)和(18.68±7.98),均显著高于对照组的(1.32±0.70)、(29.07±7.15)和(15.28±8.23),差异均具有统计学意义(均P＜0.05);观察组治疗后CD8+细胞百分比(25.56±8.90)与对照组(26.64±6.77)差异无统计学意义(P＞0.05),呕吐、白细胞降低、血小板降低的患者少于对照组,差异均具有统计学意义(均P＜0.05);观察组患者1年生存率为52.63％明显高于对照组患者的42.11％,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 DC-CIK细胞联合替吉奥治疗非小细胞肺癌能有效提高临床疗效,延长患者的生存时间,是一种安全、有效的治疗方案.     

苦豆子生物碱对体外培养的肺癌细胞的抑制作用

目的 对4种苦豆子生物碱的体外抗肺癌活性及机制进行研究,并评价其对正常细胞的毒性,以期筛选出具有高效低毒抗肿瘤作用的药物.方法 用噻唑蓝（MTT）法测定4种苦豆子生物碱对人肺癌细胞和仓鼠肺细胞增殖活性的影响;用激光共聚焦显微镜观察Hochest33342染色后肺癌细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）双染后肺癌细胞的凋亡率.结果 4种苦豆子生物碱对肺癌细胞的生长具有不同程度的抑制作用,呈剂量依赖关系,以氧化槐定碱的抗肺癌活性最强,且对正常肺细胞的毒性较小;Hochest33342染色和流式细胞术显示氧化槐定碱可以明显诱导人非小细胞肺癌细胞A549发生凋亡和坏死.结论 4种苦豆子生物碱均具有一定的抗肺癌作用,以氧化槐定碱的活性最强,具有高效低毒的特点,适合作为抗肿瘤候选药物进一步开发.     

MUC1 mRNA体外负载树突状细胞诱导细胞毒性T细胞对非小细胞肺癌的杀伤作用

 目的：将体外扩增的黏蛋白1 （MUC1） mRNA转染入成熟的树突状细胞（DCs）,观察其体外诱导的特异性抗肿瘤效应。方法：将分离提纯的单核细胞培养诱导为DC并用流式细胞术鉴定。构建pcDNA3.1（+）-MUC1质粒,体外转录为mRNA,电穿孔法转染DCs。定量 PCR检测转染的DCs中MUC1的表达;MTT法检测T细胞增殖情况;流式细胞术检测CD8+ 在T细胞的表达;LDH释放法测定细胞毒性,ELISA检测IFN-γ分泌水平。结果：流式细胞术结果表明成熟DCs标志表型的表达明显高于对照组。定量PCR结果说明转染后的DCs MUC1 mRNA相对表达量增高。转染组DCs与T细胞按1∶10共培养时,刺激增殖能力明显高于未转染组,且CD8+  T细胞表达率高于未转染组,诱导产生特异性的细胞毒性T细胞杀伤表达MUC1蛋白的靶细胞,而未转染组的杀伤作用较弱。转染组DCs与T细胞共培养的上清中IFN-γ的分泌水平高于未转染组。结论：电穿孔法可以将MUC1 mRNA成功转染至DCs,产生特异性杀伤效应,为以MUC1为靶点的非小细胞肺癌的免疫治疗提供实验和理论依据。     

PDK1对肺癌A549细胞生物学行为的影响

目的:探讨3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)对肺癌细胞株A549生物学特性的影响及其潜在的作用机制。方法:采用Western blot和real-time PCR检测肺正常上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞(H460、SPCA1和A549)中PDK1的表达水平。利用RNA干扰技术下调肺癌A549细胞中PDK1的表达,然后分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力及凋亡的变化;Western blot检测增殖及周期相关蛋白的表达和Akt/Fox O1信号通路的活性。最后通过Akt信号通路特异性激动剂胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)进一步验证PDK1和Akt/Fox O1信号通路的相互作用。结果:相较于肺正常上皮细胞BEAS-2B,肺癌细胞中的PDK1均呈高表达(P0.05)。干扰A549细胞中PDK1的表达后,细胞活力显著降低,周期进程缓慢,而细胞凋亡显著增加。Western blot实验结果显示,干扰PDK1后,细胞中cyclin D1、CDK4、p-Rb、Bcl-2、p-Akt及胞浆中p-Fox O1的含量显著下降,P27、cleaved caspase-3及核内Fox O1的蛋白水平显著升高(P0.05)。预先给予Akt激动剂IGF-1可部分逆转干扰PDK1对Akt/Fox O1信号通路的影响,并增加A549细胞的活力(P0.05)。结论:干扰人肺癌细胞株A549的PDK1可通过抑制Akt/Fox O1信号通路而调控周期及凋亡相关因子的表达,发挥生长抑制及凋亡促进作用,提示PDK1可作为肺癌的潜在诊疗靶点。