miRNA-31在高糖诱导内皮细胞功能障碍中的作用

目的 探讨miRNA-31在高糖诱导的内皮细胞功能障碍中的作用机制.方法 体外培养人冠状动脉内皮细胞系,不同浓度高糖刺激24h后检测细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及培养上清液NO含量;Real-time PCR检测高糖刺激后miRNA-31表达变化;microRNA在线分析软件预测并应用双荧光素酶报告基因系统和Western blot验证eNOS是否为miRNA-31的直接靶基因;通过转染miRNA-31 antagomir观察miR-NA-31对内皮细胞功能障碍的影响.结果 不同浓度的高糖刺激内皮细胞24h后,eNOS蛋白表达和培养液NO含量呈剂量依赖性下降.高糖刺激内皮细胞miRNA-31表达明显增加.microRNA在线分析软件及双荧光素酶报告基因实验提示eNOS的翻译水平受miRNA-31直接调控.转染miRNA-31 antagomir明显上调高糖刺激后内皮细胞eNOS蛋白和培养液NO含量.结论 miRNA-31上调进而抑制eNOS表达可能是高糖诱导内皮细胞功能障碍的作用机制之一.     

内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化.方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况.结果 RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120 h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05).转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异.结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定.     

大黄素对兔颅骨成骨细胞NO／NOS表达的影响

目的 探讨大黄素对体外培养兔卢贾骨成骨细胞一氧化氮/一氧化氮合成酶(NO/NOS)系统的调控作用.方法 将体外培养的成骨细胞用不同浓度的大黄处理1、24、48、72h,通过Western-blot检测细胞NOS的蛋白表达量,使用NOS分型试剂盒测定细胞NOS的酶活性,通过硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO浓度.结果 大黄能够促进成骨细胞eNOS的蛋白表达,增加eNOS的酶活性,提高细胞培养液中NO的浓度;对iNOS表达及酶活性的作用无统计学意义.结论 大黄可通过调节成骨细胞的NO/NOS系统,促进成骨细胞的增殖分化从而影响骨代谢.     

染色质重构复合体蛋白PBRM1对膀胱癌细胞生物学功能的影响

目的探讨染色质重构复合体蛋白PBRM1对膀胱癌细胞株EJ、T24细胞生物学功能的影响。方法针对PBRM1 mRNA序列设计合成siRNA,转染膀胱癌细胞,沉默PBRM1基因后进行如下检测：RT-PCR法检测PBRM1 mRNA表达变化及凋亡、迁移相关指标;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western印迹法检测凋亡蛋白Caspase3表达水平;划痕实验及Matrigel实验检测细胞迁移及侵袭能力变化。结果 PBRM1siRNA能有效抑制膀胱癌细胞中PBRM1的表达。PBRM1基因沉默后,与空白对照组相比,细胞增殖能力显著增强,同时细胞凋亡减少,细胞迁移及侵袭能力明显减弱。凋亡及迁移相关基因mRNA水平及蛋白水平也出现相应变化。结论 PBRM1对膀胱癌细胞株EJ、T24生物学功能有重要影响,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡、迁移及侵袭。     

miRNA-375 靶向磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位 α 对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨miRNA-375 靶向磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位α（PIK3CA）对宫颈癌细胞增殖和 迁移的影响。方法 选取宫颈癌细胞系SiHa,分别转染miRNA-375 模拟基因、miRNA-375 抑制剂、对照模拟 基因及对照抑制剂,采用RT-PCR 法检测miRNA-375 表达,Western blot 检测PIK3CA 蛋白表达,MTT 法检 测细胞增殖活性,划痕实验检测细胞迁移能力。双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-375 与PIK3CA 的靶向 关系。结果 转染miRNA-375 模拟基因后miRNA-375 表达上调,PIK3CA 蛋白表达降低（P <0.05）;转染 miRNA-375 抑制剂后miRNA-375 表达降低,PIK3CA 蛋白表达增强（P <0.05）。转染miRNA-375 模拟基 因后SiHa 细胞增殖活性、迁移能力降低（P <0.05）;转染miRNA-375 抑制剂后SiHa 细胞增殖活性、迁移 能力增强（P <0.05）。miRNA 靶基因预测软件检测结果显示,miRNA-375 能作用于PIK3CA 3''-UTR。与转 染对照模拟基因比较,共转染miRNA-375 模拟基因与PIK3CA-WT 可使SiHa 荧光素酶活性降低（P <0.05）。 结论 miRNA-375 可抑制宫颈癌细胞增殖及迁移,其机制可能与靶向调控PIK3CA 有关。     

miRNA-149抑制膀胱癌细胞侵袭的初步分子机制研究

目的探讨miRNA-149抑制膀胱癌细胞侵袭的可能分子机制。方法采用PolyJet~( TM)DNA In Vitro Tranfection Reagent将miRNA-149过表达质粒稳定转染膀胱癌细胞T24、T24T,并用荧光定量PCR技术检测转染率;利用免疫蛋白印迹法检测EMT标志蛋白及miRNA-149下游靶基因IGFBP5和PDGFRA蛋白的表达。结果在T24、T24T细胞中成功过表达miRNA-149,且差异具有统计学意义(P0.05)。miRNA-149显著抑制膀胱癌细胞EMT发生,从而抑制膀胱癌细胞侵袭。进一步机制研究发现miRNA-149可抑制其下游靶基因IGFBP5和PDGFRA蛋白的表达。结论该研究表明miRNA-149抑制膀胱癌侵袭可能与EMT的发生及其下游基因IGFBP5和PDGFRA的表达密切相关,为临床膀胱癌的转移研究提供了新的启示。     

应用UTMD技术联合脂质体转染介导人肝癌细胞表达miRNA-122的研究

目的:探讨应用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术和脂质体介导质粒miRNA-122在人肝癌HCCLM3细胞表达后细胞增殖、迁移和侵袭能力以及耐药性的变化。方法:构建pLMP-miR-122质粒。将对数期肝癌细胞株HCCLM3分组转染:A组(对照组)、B组(脂质体+质粒组)、C组(超声微泡+质粒+超声辐照组)、D组(脂质体+超声微泡+质粒+超声辐照组)。采用荧光定量PCR法检测pre-miRNA-122表达水平比较各组细胞转染效率,以CCK-8法检测细胞活性,应用划痕实验和Transwell实验检测细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质免疫印迹检测蛋白表达情况。结果:HCCLM3细胞miRNA-122过表达后,细胞的增殖、迁移、侵袭能力与对照组比较均显著受到抑制,且对化疗药物敏感性增加,抗凋亡蛋白Bcl2表达下调。结论:UTMD技术结合脂质体转染法可以提高质粒转染人肝癌细胞HCCLM3效率,并且miRNA-122上调后可以明显抑制HCCLM3增殖、迁移和侵袭能力,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

Effects of Up-regulated Expression of miRNA-101 on Cell Proliferation of HepG2 Cells

目的 通过上调人肝癌HepG2细胞株中miRNA-101表达,探讨miRNA-101抑制靶基因EZH2对肝癌细胞增殖的影响.方法 人工合成miRNA-101模拟体并转染至HepG2肝癌细胞株中,利用MTT法检测细胞增殖抑制、流式细胞仪检测细胞周期、实时荧光定量PCR检测EZH2 mRNA表达.结果 miRNA-101模拟体转染组HepG2细胞增殖活性明显低于阴性对照组及空白对照组(P＜0.05),miRNA-101模拟体组G0/G1期细胞明显增多,为(74.71±4.6)%,S期细胞减少,为(14.57±1.1)%(P均＜0.05);miRNA-101模拟体组EZH2 mRNA较阴性对照组和空白对照组表达下降(P＜0.05).结论 上调miRNA-101可抑制EZH2基因表达,对人肝癌细胞增殖活性具有负调控作用.     

内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化。方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况。结果RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05)。转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异。结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定。     

腺病毒介导的eNOS基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC)的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 :构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC ,应用聚合酶链 (PCR)、逆转录PCR(RT PCR)技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率 ;应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果 :外源性eNOS基因成功导入了VSMC ;VSMC中有eNOS基因mRNA的表达 ;外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后 ,可显著抑制VSMC的生长 ,DNA合成减少。结论 :腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC ,并可有效抑制细胞生长。     

溶栓前后PTE患者血浆上调内皮细胞eNOS基因表达

目的 观察急性肺血栓栓塞（FFE）患者溶栓前后血浆一氧化氮（NO）水平的变化,以及对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表达的影响。方法 采用硝酸还原酶法测定PTE患者溶栓前及溶栓4h后血浆NO浓度,溶栓前后患者血浆孵育HUVEC,RT—PCR检测eNOS mRNA的表述变化,western blot检测eNOS蛋白的表达变化。结果 急性肺血栓栓塞溶栓前后患者血浆NO水平均高于正常人血浆NO水平,且差异均有显著性（P〈0．05）;而患者溶栓前后血浆NO水平相比,差异无显著性（P〉0．05）;患者溶栓前后血浆孵育HUVEC,随时间变化,其eNOS mRNA及蛋白表达均逐渐增强,相同时间点两组eNOS mRNA及蛋白的表达差异均无显著性（P〉0．05）,但均高于正常血浆孵育组（P〈0．05）。结论 PTE患者血浆NO水平显著上升,溶栓后4h内其NO水平无明显变化,P1E患者血浆能够上调HUVEC的eNOS基因表达。     

Ginsenoside Rg1-induced alterations in gene expression in TNF-α stimulated endothelial cells

Background In China the ginseng root began to be used in medicine over 2000 years ago. Ginsenosides are the most important component isolated from ginseng. The authors investigated the effect of ginsenoside Rg1 on the spectrum of gene expression in the endothelial cells stimulated by TNF-α and further explored the potential molecular mechanism of endothelial protection by ginsenoside Rg1.
Methods Nitric oxide (NO) production in the cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) was measured by using an NO assay kit. A home-made oligonucleotide microarray containing approximately 400 cardiovascular disease-related genes was constructed. The alteration of the spectrum of gene expression induced by ginsenoside Rg1 in HUVECs which were activated by TNF-α were detected by oligonucleotide microarray analysis.
Results NO production in HUVECs was decreased significantly after TNF-α treatment, while pretreatment with ginsenoside Rg1 enhanced NO production in TNF-αstimulated HUVECs. Ginsenoside Rg1 affected the expression levels of genes involved in vascular constriction, cell adherence, coagulation, cell growth and signal transduction in TNF-αstimulated HUVECs.
Conclusions Ginsenoside Rg1 could enhance NO production and the expression of eNOS mRNA in TNF-α stimulated HUVECs. Ginsenoside Rg1 regulated sets of genes in endothelial cells and protected endothelial cells from TNF-αactivation. Microarray analysis provided us with valuable insights into the atheroprotective mechanism by gingsenoside Rg1.
     

Ginsenoside Rgl-induced alterations in gene expression in TNF-α stimulated endothelial cells

Background In China the ginseng root began to be used in medicine over 2000 years ago.Ginsenosides are the most important component isolated from ginseng. The authors investigated the effect of ginsenoside Rgl on the spectrum of gene expression in the endothelial cells stimulated by TNF-α and further explored the potential molecular mechanism of endothelial protection by ginsenoside Rgl.Methods Nitric oxide (NO) production in(HUVECs) was measured by using an NOthe cultured human umbilical vein endothelial cells assay kit. A home-made oligonucleotide microarray containing approximately 400 cardiovascular disease-related genes was constructed. The alteration of the spectrum of gene expression induced by ginsenoside Rgl in HUVECs which were activated by TNF-α were detected by oligonucleotide microarray analysis.Results NO production in HUVECs was decreased significantly after TNF-α treatment, while pretreatment with ginsenoside Rgl enhanced NO production in TNF-αstimulated HUVECs.Ginsenoside Rg1 affected the expression levels of genes involved in vascular constriction, cell adherence, coagulation, cell growth and signal transduction in TNF-αstimulated HUVECs.Conclusions Ginsenoside Rgl could enhance NO production and the expression of eNOS mRNA in TNF-α stimulated HUVECs. Ginsenoside Rgl regulated sets of genes in endothelial cells and protected endothelial cells from TNF-αectivation. Microarray analysis provided us with valuable insights into the atheroprotective mechanism by gingsenoside Rg1.     

罗格列酮对人脐静脉内皮细胞NO和PI3K/PKB/eNOS信号通路的影响

目的:观察罗格列酮对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)表达的影响,探讨罗格列酮改善内皮功能的信号转导机制.方法:首先观察罗格列酮对内皮细胞NO影响的时效和量效关系,然后加用eNOS和PKB信号阻断剂进行干预.用Griess重氮化反应法检测NO浓度,RT-PCR方法检测PI3K,PKB及eNOSmRNA的表达,Western免疫印迹方法检测PKB,eNOS总蛋白和PKB丝氨酸473(PKB-Ser473),eNOS丝氨酸1177(eNOS-Ser1177)的磷酸化表达.结果:罗格列酮呈剂量和时间依赖性地升高内皮细胞NO浓度,不同浓度的罗格列酮培养内皮细胞均能升高PI3K mRNA表达和PKB-Ser473,eNOS-Ser1177磷酸化,但对PKB和eNOS表达均无影响;eNOS阻断剂L-NAME能完全阻断罗格列酮培养的内皮细胞NO浓度的升高,PI3K阻断剂LY294002能阻断罗格列酮诱导的NO产生和PKB,eNOS的磷酸化.结论:罗格列酮能通过激活PI3K/PKB/eNOS信号通路而增强内皮细胞NO的浓度,改善内皮功能.     

白藜三醇对人脐静脉内皮细胞增殖及NO表达的影响

目的观察白藜三醇对正常状态下人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HU—VECs）磷酸化蛋白激酶B（P—Akt）、磷酸化内皮型一氧化氮合酶（P-NOS）及一氧化氮（NO）表达的调节作用,探讨白藜三醇对HUVECs增殖的影响及可能机制。方法实验分组：DMEM高糖（〈4．5mg／L）培养基培养组（正常组）、白藜三醇组（分为0．2、1、5、10、20μmol／L5个剂量亚组）、白藜三醇＋LY294002组、LY294002组（阻断剂组）。其中LY294002为磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,P13-K）抑制剂。应用CCK-8法检测细胞增殖情况;Westernblot检测各组细胞内蛋白激酶B（Akt）、P—Akt、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、P-eNOS蛋白的表达;硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO的浓度。结果①白藜三醇组1、5μmol／L2个剂量亚组与正常组相比细胞增殖增加（P〈0．01）,5μmol／L亚组与0．2、10、20μmol／L亚组相比细胞增殖增加（P〈0．01）;白藜三醇20μmol／L对细胞增殖有抑制作用（P〈0．01）。②与对照组比较,白藜三醇组P-Akt（P〈0．01）、P-eNOS（P〈0．05）蛋白表达增加;与白藜三醇组比较,白藜三醇＋LY294002组P-Akt、P-eNOS蛋白表达降低（P〈0．01）。③与对照组比较,白藜三醇组NO表达增加（P〈0．05）;与白藜三醇组比较,白藜三醇＋LY294002组NO表达降低（P〈0．01）。结论白藜三醇可能通过P13-K／Akt／eNOS信号通路诱导正常状态下内皮细胞NO表达的增加,从而促进内皮细胞增殖。     

MiRNA-142-5p在大鼠角膜新生血管中的作用及机制研究

目的 观察microRNA-142-5p(miRNA-142-5p)对大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CorNV)的作用及其与VEGF/PI3 K/AKT通路的关联情况.方法 角膜缝线法诱导SD大鼠右眼CorNV作为实验组,左眼作为对照组.取缝线后第7天的角膜进行实时荧光定量聚合酶反应(Real-time PCR,RT-PCR)检测miRNA-142-5p以及VEGF mRNA的表达水平.将miRNA-142-5pmimic转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),RT-PCR检测miRNA-142-5p的表达量来验证转染是否成功.并通过RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT mRNA和蛋白的表达量.分别用Transwell、CCK-8法及Matrigel胶管腔形成实验检测HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力.结果 成功建立CorNV模型.RT-PCR结果显示7d组miRNA-142-5p(6.799±1.683)和VEGF(3.297±0.334)的表达量较正常角膜组(normal)显著升高(P＜0.01).转染miRNA-142-5p mimic后的miRNA-142-5p的表达量显著高于空白对照及阴性对照组(P＜0.01).Transwell、CCK-8及Matrigel胶管腔形成实验结果示miRNA-142-5p提高了HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力(P＜0.01).转染miRNA-142-5p mimic后HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT的mRNA及相应蛋白的表达均明显上升(P＜0.05).结论 CorNV中miRNA-142-5p及VEGF的表达明显上调,过表达miRNA-142-5p可以显著提高HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT通路各主要成员mRNA和蛋白的表达水平,进而促进HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力.表明miRNA-142-5p可通过PI3K/AKT通路参与CorNV的调控.     

波动性高糖对人脐静脉内皮细胞中NO 合成的影响及作用机制

目的：探索波动性与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞合成血管舒张因子一氧化氮（NO）的影响及其作用机制。方法：以体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为研究对象,分别测定波动性高浓度葡萄糖(5.5 或20 mmol/L) 与持续性高浓度葡萄糖(20 mmol/L)环境下NO浓度,RT-PCR及Western印迹方法检测磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B（PKB/AKT）、内皮型一氧化氮合酶(eNOS）mRNA及蛋白表达水平。结果：波动性高糖组NO均明显低于持续高糖组和正常组（P<0.05）;波动组,持续高血糖组的PI3K,PKB,eNOS mRNA及蛋白表达水平均较正常组下调（P<0.01）,而波动组又低于持续组（P<0.05）。结论：波动性高血糖较持续性高血糖可能对血管内皮细胞具有更强的损伤效应,并可能通过影响信号通路PI3K/PKB/eNOS导致NO合成减少。     

Cinaciguat对高糖损伤血管内皮细胞功能的影响

目的 糖尿病状态下，一氧化氮(NO)与可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylatecyclase,sGC)均被氧化，使NO-sGC-环磷酸鸟苷(cGMP)信号通路传导异常，NO-sGC-cGMP信号通路异常是糖尿病血管内皮功能障碍的重要病理基础。可溶性鸟苷酸环化酶激活剂(cinaciguat，CIN)可激活失活的sGC进而起到保护血管内皮细胞功能的作用。本研究通过体外实验制造高糖内皮细胞损伤模型，观察CIN对人脐静脉内皮细胞功能的影响。 方法 培养人脐静脉内皮细胞，并将细胞分为正常对照组、高糖组、CIN干预组，每组6例。高糖组及CIN干预组均加入33.3 mmol/L的葡萄糖制造高糖细胞损伤模型，而CIN组同时加入0.1 μmol/L CIN干预。各组细胞在培养6、24、48 h时，检测上清液中的NO水平及细胞内一氧化氮合酶(NOS)浓度；培养48 h后RT-PCR检测细胞内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达；培养48 h后Western blotting检测细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及血管粘附分子-1(VCAM-1)蛋白的表达。 结果 与正常对照组相比，高糖组NO、NOS含量呈现早期升高晚期下降的趋势，而CIN组上述趋势消失；与正常组比较，高糖组内皮细胞的eNOS mRNA表达水平降低(P＜0.05)，iNOS mRNA、ICAM-1与VCAM-1蛋白表达明显升高(P＜0.05)，而CIN组eNOS mRNA表达水平较高糖组明显升高(P＜0.05)，iNOS、ICAM-1与VCAM-1蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05)。 结论 CIN可平衡NOS的活性，调节NO的生成及ICAM-1与VCAM-1的表达，改善高糖状态下内皮细胞的功能。