次声刺激诱导原代培养大鼠星形胶质细胞释放谷氨酸的研究

摘要 目的：观察16Hz, 130dB次声刺激对原代培养的大鼠星形胶质细胞谷氨酸释放的影响,并探讨其释放机制。 方法：原代培养大鼠海马区星形胶质细胞,将其分为次声刺激组（IE group,n=6）,Gap26+次声刺激组（Gap26+IE group）,对照组（Ctrl group,n=6）。次声刺激组细胞暴露于次声舱中,分别给予15min, 30min, 60min, 90min, 120min和240min的次声刺激;对于Gap26+IE组,则在次声刺激前,选用Cx43半通道阻断剂Gap26预处理星形胶质细胞;对照组也置于次声舱,但不给予次声刺激。次声刺激频率为16Hz,强度为130dB。为了排除Gap26对谷氨酸释放的影响,还选用乱序Gap26肽段(Scrb Gap26)来预处理星形胶质细胞（Scrb Gap26+IE group,n=6）。采用免疫荧光染色测定细胞Cx43的表达情况,采用高效液相色谱（HPLC）来测定细胞外液谷氨酸浓度。 结果：次声刺激后,IE组细胞外液谷氨酸的浓度显著升高,并在刺激90min后,细胞外液谷氨酸浓度达峰值,为（4.6±0.3）nmol/ml,显著高于对照组（2.3±0.2）nmol/ml（P<0.05）,这说明次声刺激可以显著增高星形胶质细胞外液的谷氨酸含量。此外,次声刺激后,IE组细胞Cx43的表达也显著升高,刺激60mins时,Cx43平均荧光强度达到峰值,为（198±33）(AUC),显著高于对照组（P<0.05）。而对于Gap26+IE组,次声刺激后细胞外液谷氨酸浓度的升高受到抑制,90min后,细胞外液谷氨酸浓度为（3.58±0.17）nmol/ml,显著低于次声刺激组（P<0.05）。 结论：次声刺激可以诱导星形胶质细胞释放谷氨酸;Cx43半通道阻断剂Gap26抑制了谷氨酸释放,次声刺激诱导的谷氨酸释放可能是通过Cx43半通道来完成的。     

谷氨酸引起培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4表达动态变化

目的研究谷氨酸是否引起培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达变化。方法利用传代培养至10d左右的大鼠星形胶质细胞,给予1mmol/LL-谷氨酸钠,分别作用1h、3h、6h、12h、24h、48h后进行细胞形态学观察、GFAP免疫化学染色及荧光定量PCR检测AQP4mRNA表达变化。结果谷氨酸作用1h后星形胶质细胞出现肿胀并随着作用时间延长肿胀持续,AQP4mRNA3h时开始出现表达降低(P0.05),后随谷氨酸作用时间延长先下调后上调,12h达最低(P0.01),48h升至高于正常(P0.05)。结论AQP4可能在谷氨酸引起星形胶质细胞肿胀发生发展中发挥作用。     

olomoucine对星形胶质细胞增殖的影响及机制研究

目的:观察细胞周期抑制剂olomoucine对培养星形胶质细胞(AS)机械损伤后增殖的影响,并探讨其作用机制。方法:建立体外培养大鼠纯化的AS物理损伤模型(划痕损伤模型),随机分为对照组、划痕组和干预组,划痕组和干预组均继续培养,干预组给予olomoucine干预。利用免疫荧光细胞化学方法观察损伤后BrdU表达;利用Westernblot印迹分析损伤后PCNA、p27的表达。结果:划痕损伤刺激12h开始出现损伤边缘区AS胞体肥大、数目增加,BrdU阳性细胞比率和PCNA表达水平较对照组增高(P<0.05),p27表达水平较对照组下降(P<0.05);干预组的BrdU阳性细胞比率和PCNA表达水平较划痕组明显减少(P<0.05),p27表达上调(P<0.05)。结论:损伤刺激可促使AS发生反应性胶质增生,CDK选择性细胞周期抑制剂olomoucine可以通过调控细胞周期抑制其反应性增生。     

磁刺激通过星形胶质细胞磷酸化蛋白影响星形胶质细胞迁移

目的 研究1.0Hz 60%最大刺激强度的磁刺激通过调控星形胶质细胞磷酸化蛋白（PEA-15）对星形胶质细胞迁移的影响。 方法 取第3～4代体外分离培养的大鼠星形胶质细胞,分为对照组、转染组、磁刺激组和转染+磁刺激组。对照组进行阴性siRNA转染,转染组应用化学合成的siRNA进行脂质体瞬时转染,干扰PEA-15的蛋白表达;磁刺激组的星形胶质细胞在铺板24h后接受60%最大强度磁刺激;转染+磁刺激组进行PEA-15的siRNA转染,并给予60%最大强度磁刺激。用细胞划痕试验检测星形胶质细胞的迁移程度,用免疫印迹试验检测PEA-15的蛋白表达和磷酸化水平变化。 结果 ①PEA-15 siRNA的转染效果明显,Western Blot检测与对照组比较,PEA-15的蛋白表达明显降低。②体外划痕实验中,转染组、磁刺激组、转染+磁刺激组的细胞迁移面积分别与对照组比较,其星形胶质细胞迁移程度增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。③与对照组相比,磁刺激组的PEA-15磷酸化明显增加。 结论 干扰PEA-15表达后的星形胶质细胞迁移增加明显;磁刺激可通过增强PEA-15磷酸化促进星形胶质细胞的迁移。     

昼夜节律紊乱对星形胶质细胞功能的影响

星形胶质细胞是中枢神经系统分布最广泛的一类细胞,具有神经支持、维持血脑屏障稳定、调节脑脊液循环及参与神经炎症等功能。研究表明,星形胶质细胞具有极强的昼夜节律,并参与自身功能的调节。本文总结了昼夜节律紊乱对星形胶质细胞功能的影响,重点讨论昼夜节律紊乱情况下,内淋巴循环障碍、神经元氧化应激与炎症、神经递质代谢异常以及突触功能改变,及其与神经退行性疾病之间的可能存在的联系。     

星形胶质细胞参与神经病理痛机制的研究进展

对于神经损伤所致的神经病理痛处理一直是临床上面临的巨大挑战,这主要归咎于我们对此类疼痛的起源及维持过程的分子机制了解甚微。近年来逐渐认识到,中枢神经系统中的胶质细胞(如星形胶质细胞和小胶质细胞)在神经病理痛的发展及维持上扮演着重要的角色。值得注意的是,星形胶质细胞与突触保持着紧密的联系,并且在神经损伤后的反应要比小胶质细胞更加持久,因此它与神经病理痛的关系更加密切。本文主要就星形胶质细胞的起源、分类、一般功能,疼痛中星形胶质细胞的激活方式,以及其参与神经病理痛调节的最新机制研究等进行综述。     

星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

目的:研究表明,星形胶质细胞产生一系列可溶性因子和膜相关因子,对中枢神经系统的发育和功能的成熟起了重要的作用。将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,探讨星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法:实验于2005-03/2006-02在广西医科大学实验中心完成。①实验材料:生后0～2d新生SD大鼠由广西医科大学实验动物中心提供。②实验方法:分离培养新生大鼠海马神经干细胞。采用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化新生大鼠脑组织星形胶质细胞,以胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞,应用免疫细胞化学染色法进行细胞纯度鉴定。将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养:共培养组是将培养瓶中的星形胶质细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液,加入完全培养液,待细胞均匀长满后,换神经干细胞基础培养液,孵育24h后,将涂有多聚赖氨酸的盖玻片放入6孔板中,将传代1个月的神经干细胞球种到盖玻片上,同时更换神经干细胞基础培养液继续培养。对照组是单纯接种神经干细胞球于置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的6孔培养板内。③实验评估:采用免疫细胞化学染色法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和酪氨酸羟化酶表达。结果:纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性,细胞纯度达95%。星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞及酪氨酸羟化酶阳性细胞明显多于对照组(P<0.05)。结论:星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元细胞,包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生,可能是星形胶质细胞及其分泌的因子维持并延长了神经元存活,降低了凋亡比率所致。     

NR2B反义寡核苷酸对大鼠脊髓星形胶质细胞体外分泌TNF-α及释放谷氨酸的影响

目的:观察N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)反义寡核苷酸对体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞(AST)分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α及释放谷氨酸(Glu)的影响。方法:取新生2～3d新生的SD大鼠L4～6脊髓背角AST细胞原代纯化培养,C组:正常对照,除加入与干预组等量的培养液外不加任何药物;脂多糖(LPS)组:在培养液中加入LPS,终浓度为1mg/L,孵育24h;SNR2B组:在培养液中加入经lipofectamine2000处理的NR2B反义寡核苷酸,终浓度为2μmol/L,孵育48h后再加入LPS,终浓度1mg/L,再孵育24h;ANR2B组:在培养液中加入经lipofectamine2000处理的NR2B正义寡核苷酸,终浓度为2μmol/L,孵育72h后再加入LPS,终浓度1mg/L,孵育24h;5000r/min离心15min后取上清液和细胞,分别用于TNF-α、Glu和NR2B mRNA检测。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中TNF-α的浓度;用高效液相色谱仪测定Glu含量,RT-PCR检测NR2B mRNA的表达。结果:与C组比较,LPS组和ANR2B组释放的TNF-α和Glu显著增加(P<0.01),而SNR2B组无显著变化;与LPS组和ANR2B组相比,SNR2B组释放的TNF-α和Glu减少(P<0.01)。与C组比较,LPS组和ANR2B组AST细胞的NR2B mRNA的表达显著升高(P<0.01),而SNR2B组差异无显著性。结论:NR2B反义寡核苷酸下调脊髓AST细胞NR2B mRNA表达,减少TNF-α和Glu的释放。     

缺血对体外培养星形胶质细胞凋亡及细胞周期的影响

目的:研究缺血干预不同时间对体外培养的星形胶质细胞(Ast)凋亡及细胞周期的影响。方法:分离新生大鼠皮质,获得细胞悬液,通过培养、分离和传代方法纯化Ast,经体外缺血条件(氧及血清剥夺,低糖)干预3、6、12和24h后收集细胞,PI染色。流式细胞仪检测每个样品单个细胞DNA含量,测算每个样品中处于凋亡及各周期细胞的百分比。结果:对照组与各缺血干预组进行组间比较,凋亡百分比无显著性差异。观察期内Ast始终未出现凋亡。缺血3、6、12hAstS期及G2/M期百分比较对照组显著增高,缺血6h达最高值。结论:Ast对缺血有一定的耐受性,缺血早期Ast反应性增生。     

不同浓度异丙酚对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞损伤的影响

目的:观察不同浓度异丙酚对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞损伤的影响。方法:取新生2～3dWistar大鼠T12～L6脊髓背角星形胶质细胞,原代纯化培养。将细胞随机分为7组(n=9),正常对照组(C组)加入Hanks液;乳剂对照组(L组)加入乳剂0.2mL/L;谷氨酸组(G组)加入谷氨酸至终浓度100μmol/L;异丙酚组(P组)加入异丙酚至终浓度50μmol/L;GP1、GP2、GP3组先加入谷氨酸至终浓度100μmol/L,10min后分别加入异丙酚至终浓度5、25、50μmol/L。培养30min后取各组细胞检测犤Ca2+犦i,再培养24h取各组细胞检测细胞凋亡、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:与C组比较,G组和GP1组细胞凋亡增加(P<0.01),犤Ca2+犦i显著升高(P<0.01),MDA含量增加,SOD活性显著降低(P<0.01),G组与GP1组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与G组比较,GP2组和GP3组凋亡细胞减少(P<0.01),犤Ca2+犦i降低,MDA含量降低,SOD活性增加(其中GP2组P<0.05,GP3组P<0.01)。C组与L组比较各指标差异...     

X射线对体外培养星形胶质细胞增殖的影响及机制研究

目的：观察X射线照射对培养星形胶质细胞（AS）增殖的影响,为X射线的广泛应用提供理论依据。方法：将体外培养80%汇合的AS,在AS无血清培养基继续培养48h后分为对照组和放疗组,对照组更换含10%FBS的DMEM-F12培养基,放疗组更换含10%FBS的DMEM-F12培养基,并同时给与X射线照射,利用western印迹分析各组PCNA、p53、cyclinE的表达。结果：X射线照射后能降低S期细胞比率,呈剂量依赖性,但并不增加AS的凋亡率。通过对AS无血清培养48h后,大部分细胞周期同步于G0期,对照组更换培养基后12h出现PCNA、cyclinE表达水平增高;放疗组p53表达水平较对照组显著增高,PCNA、cyclinE表达水平较对照组显著降低。结论：X射线照射可以通过调控细胞周期有效抑制AS的增生。     

双孔钾通道TREK-1活性对缺氧条件下星形胶质细胞增殖的影响

目的:研究双孔钾通道TREK-1对体外培养的星形胶质细胞缺氧条件下活化增殖的影响。方法:离体培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞,采用流式细胞术和BrdU掺入法检测其在缺氧条件下及给予TREK-1通道阻断剂干预后的活化增殖特点。结果:缺氧导致处于S期的星形胶质细胞明显增加,缺氧6h增加最明显;抑制TREK-1活性可加剧缺氧条件下星形胶质细胞的活化增殖。结论:星形胶质细胞的TREK-1活性与缺血缺氧状态下细胞的活化增殖密切相关。     

Ca2+Entry Through TRPC1 Channels Contributes to Intraceilular Ca2+ Dynamics and Consequent Glutamate Release from Rat Astrocytes

各种不同的刺激作用于星型胶质细胞,可以导致胞浆内Ca2 浓度增加,进而释放更多谷氨酸作用于周边的神经元.大部分Ca2 来源于细胞内,小部分来源于细胞外.Ca2 内流是通过钙池操纵Ca2 通道(SOC)实现的.因此,作者观察在星型胶质细胞内Ca2 激活与谷氨酸释放过程中钙池操纵Ca2 通道(SOC)发挥了什么样的作用.已有研究显示星型胶质细胞所表达的TRPC通道(Ca2 通过瞬时受体电位通道相关蛋白)介导了钙池操纵Ca2 的内流.本文发现培养的星形胶质细胞以及从视皮质中新分离的星形胶质细胞表达TRPC1,TRPC4,和TRPC5.间接免疫组化显示这些蛋白存在于整个细胞中.然而机能检测TRPC1主要表达在质膜上.在新分离的星形胶质细胞中做标记,显示了在细胞发育过程中TRPC表达的改变.应用抗TRPC1的抗体.可以阻断TRPC1通道并且可以测定它们在培养的星形细胞的机械性和激动剂触发的钙离子内流过程中的作用.阻断TRPC1可以减少机械诱导的钙离子依赖性的谷氨酸盐的释放.这些实验数据表明.钙离子通过TRPC1通道的内流有助于钙离子在星形细胞中的信号传导以及由此引起的谷氨酸盐的释放.     

双孔钾通道TREK-1在神经细胞正常及缺氧条件下的表达研究

目的:研究双孔钾通道TREK-1在神经元及星形胶质细胞的表达,及在缺氧时星形胶质细胞中的表达变化。方法:离体培养大鼠皮质神经元和星形胶质细胞,利用免疫荧光染色法观察TREK-1蛋白在神经元和星形胶质细胞的表达分布,对星形胶质细胞进行缺氧干预,实时PCR观察缺氧不同时间TREK-1的表达变化。结果:TREK-1通道在神经元和星形胶质细胞均有表达,缺氧时TREK-1在星形胶质细胞中呈先上升,后逐渐下降的趋势。结论:TREK-1在神经元和星形胶质细胞中均有表达,星形胶质细胞中TREK-1的表达在缺氧损伤中发生动态变化。     

半乳糖凝集素-1对低氧去血清培养星形胶质细胞表达和分泌BDNF的影响

目的：研究不同浓度半乳糖凝集素-1（Gal-1）对低氧去血清培养的星形胶质细胞表达和分泌脑源性神经营养因子（BDNF）的影响。方法：建立星形胶质细胞原代培养,设定10mg／L Gal—1组、1mg／L Gal-1组、0．1mg／LGal-1组和对照组分别予以10、1、0．1、0mg／LGal-1干预并进行低氧去血清培养,在低氧去血清培养1h、3h、6h、12h、1d、3d时通过RT—PCR、Western blotting、ELISA检测星形胶质细胞BDNFmRNA、蛋白的表达水平和培养上清液中细胞分泌的BDNF的浓度。结果：与对照组比较,10mg／L Gal—1组低氧去血清培养3h～1d星形胶质细胞合成BDNF持续增加,6h～3d星形胶质细胞分泌BDNF明显增多,均以6h时最为明显;1mg／L Gal-1组低氧去血清培养12h--1d星形胶质细胞合成BDNF明显增加,但分泌BDNF没有明显变化;0．1mg／L Gal-1组对低氧去血清培养各时问点星形胶质细胞表达和分泌BDNF均无明显变化。结论：10mg／L Gal-1能有效促进低氧去血清培养的星形胶质细胞表达和分泌BDNF;Gal-1可能通过此途径在脑缺血后起到神经保护作用。     

Ca^2＋ Entry Through TRPC1 Channels Contributes to Intracellular Ca^2＋ Dynamics and Consequent Glutamate Release from Rat Astrocytes

各种不同的刺激作用于星型胶质细胞,可以导致胞浆内Ca2+浓度增加,进而释放更多谷氨酸作用于周边的神经元。大部分Ca2+来源于细胞内,小部分来源于细胞外。Ca2+内流是通过钙池操纵Ca2+通道(SOC)实现的。因此,作者观察在星型胶质细胞内Ca2+激活与谷氨酸释放过程中钙池操纵Ca2+通道(SOC)发挥了什么样的作用。已有研究显示星型胶质细胞所表达的TRPC通道(Ca2+通过瞬时受体电位通道相关蛋白)介导了钙池操纵Ca2+的内流。本文发现培养的星形胶质细胞以及从视皮质中新分离的星形胶质细胞表达TRPC1,TRPC4,和TRPC5。间接免疫组化显示这些蛋白存在于整个细胞中,然而机能检测TRPC1主要表达在质膜上。在新分离的星形胶质细胞中做标记,显示了在细胞发育过程中TRPC表达的改变。应用抗TRPC1的抗体,可以阻断TRPC1通道并且可以测定它们在培养的星形细胞的机械性和激动剂触发的钙离子内流过程中的作用。阻断TRPC1可以减少机械诱导的钙离子依赖性的谷氨酸盐的释放。这些实验数据表明,钙离子通过TRPC1通道的内流有助于钙离子在星形细胞中的信号传导以及由此引起的谷氨酸盐的释放。     

Valproate Prevents Dysregulation of Spinal Glutamate and Reduces the Development of Hypersensitivity in Rats After Peripheral Nerve Injury

The present study examined whether the histone deacetylase inhibitor valproate prevents downregulation of glutamate transporters in the primary cultured astrocytes and in the spinal cord after L5-L6 spinal nerve ligation (SNL) and whether this action of valproate on spinal glutamate transporters prevents spinal glutamate dysregulation and development of hypersensitivity after SNL. In cultured astrocytes, valproate prevented downregulation of glutamate transporter-1 (GLT-1) and glutamate-aspartate transporter in a concentration-dependent manner. Repeated oral administration of valproate reduced the development of hypersensitivity and prevented the downregulation of spinal GLT-1 and glutamate-aspartate transporter expression in rats after SNL, but did not affect mechanical nociception and expression of those transporters in normal rats. Valproate's effects on hypersensitivity and spinal GLT-1 expression in SNL rats were blocked by intrathecal administration of the selective GLT-1 blocker dihydrokainic acid or the GLT-1 selective small interfering RNA (siRNA). Extracellular glutamate concentration in the spinal cord, measured by microdialysis, was increased in animals with SNL or after GLT-1 selective siRNA treatment, and valproate prevented the SNL-induced glutamate increase. These results suggest that valproate reduces the development of chronic pain after nerve injury in part by preventing downregulation of glutamate transporters, especially GLT-1, to maintain normal extracellular glutamate concentrations in the spinal cord.     

电针风池对急性脑梗死大鼠脑星形胶质细胞和神经元的保护效果

目的 探讨电针风池穴对急性脑梗死大鼠脑星形胶质细胞和神经元的调节作用.方法 清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠64只,随机数字表法分为假手术组(n=16)、模型组(n=16)、非穴组(n=16)和风池组(n=16).后三组采用改良线栓法制备急性脑梗死模型,后两组于造模后分别电针风池旁非穴部位和风池,共7 d.治...     

小鼠耳蜗神经及其与内毛细胞突触后谷氨酸受体发育的特点

  目的  了解小鼠耳蜗神经发育特点及耳蜗内毛细胞与蜗神经突触后谷氨酸受体发育的时间特点。  方法  采用免疫组化方法, 通过共聚焦显微镜观察和记录不同发育阶段小鼠前庭耳蜗神经/耳蜗神经纤维及内毛细胞与蜗神经纤维突触后谷氨酸受体(glutamate receptor, GluR)2和3的发育与分布。  结果  胚胎9.5 d(E9.5)在听囊听上皮、前庭耳蜗神经核团及面神经核团中即可观察到NeuroD高信号表达; L1在面神经核团亦开始有明显表达。至E12.5, L1和Tuj1在前庭耳蜗神经核团和面神经核团均有强信号表达, 表达位置基本重合; 在听上皮组织可观察到明确的Tuj1信号, 显示听上皮与前庭耳蜗神经核团间神经纤维联系已建立。E12.5, 还可发现前庭耳蜗神经核团和神经管核团间神经纤维, 显示前庭耳蜗神经中枢方向的神经纤维已经发育。E13.5, 耳蜗内可见L1和Tuj1在螺旋神经核团及神经纤维结构中高信号表达, 提示内耳分化为耳蜗和前庭两个部分后传入神经进一步发育。E16.5, 自螺旋神经节至毛细胞的神经纤维清晰可见, L1和Tuj1高信号表达; 同时可以看到耳蜗内毛细胞周围有大量神经纤维分布; 但内毛细胞周围未见明显谷氨酸受体(GluR2/R3)表达。E18.5可以看到耳蜗内毛细胞周围大量神经纤维分布, 神经纤维末梢有高信号GluR2/R3表达。出生后1 d, 内毛细胞底部周围突触后GluR2/R3信号更为明显, 并为L1标记的神经纤维所包裹, GluR2/R3与L1信号共标记, 主要位于靠近内毛细胞底部的神经纤维末梢。  结论  小鼠耳蜗神经元与感觉上皮和中枢神经系统在胚胎发育较早期即建立了纤维联系, 神经纤维支配的建立早于内毛细胞成熟; 而内毛细胞与蜗神经纤维的突触联系在胚胎发育晚期及出生后才逐渐发育和完善。