治疗性人乳头瘤病毒16型疫苗的人参皂苷单体佐剂筛选研究

目的 研究不同人参皂苷单体佐剂对治疗性人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus type 16,HPV16）重组疫苗免疫效果的影响,筛选合适的人参皂苷单体作为候选佐剂。方法 选择5种人参皂苷单体Rb1、Rh1-1、Rh1-2、Rg1、Rg3,分别与治疗性HPV16重组疫苗联合免疫C57BL/6小鼠,用酶联免疫斑点试验比较各组小鼠的特异性细胞免疫应答水平,同时比较这5种人参皂苷单体对治疗性HPV16重组疫苗抑制小鼠肿瘤生长的影响。结果 人参皂苷单体Rg1、Rb1可以显著提高治疗性HPV16重组疫苗特异性细胞免疫应答（HPV+Rg1组vs HPV组：t=3.729,P=0.006;HPV+Rb1组vs HPV组：t=3.204,P=0.013）,同时可以在小鼠特异性肿瘤模型建立4周时,有效抑制肿瘤的生长水平（HPV+Rg1组vs HPV组：t=2.318,P=0.032;HPV+Rb1组vs HPV组：t=2.258,P=0.037）。结论 人参皂苷单体Rg1、Rb1能在C57BL/6小鼠中提高治疗性HPV16重组疫苗的特异性免疫效果,有望成为候选佐剂。     

HMGB1对HPV16型重组腺病毒载体疫苗免疫效果的影响及机制研究

目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)分子与人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7重组腺病毒载体疫苗免疫效果的关系及机制。方法 通过TC-1细胞移植诱导建立小鼠肿瘤模型,在接种HPV重组腺病毒载体疫苗的同时,给与HMGB1特异性拮抗剂HMGB1 A box注射,开展肿瘤抑制试验、小鼠免疫状态观察、肿瘤相关信号检测等研究。结果 A box蛋白与疫苗联用,即可显著降低模型小鼠HMGB1血清水平,抑制肿瘤组织中NF-kB的mRNA高表达,提高疫苗的抗肿瘤活性。同时,它还可减少IL-4、促进IFN-g产生,使体内免疫平衡由Th2向Th1偏移。虽然A box对于Bax的影响并不显著,但在接种疫苗并注射A box蛋白后,由肿瘤引起的NF-kB、Bcl-2、c-IAP2、VEGF、MMP-9的表达提高、Bax表达降低均得到显著扭转。结论 HMGB1分子可以削弱HPV重组腺病毒载体疫苗的免疫效果,其机制可能是HMGB1在调节免疫平衡状态及控制肿瘤细胞的凋亡、浸润、转移等多层面均能参与并发挥重要作用。     

密码子优化的HPV6b L1 DNA诱导BALB/c小鼠产生增强的免疫应答

目的 探讨真核细胞偏好密码子优化对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b型L1 DNA诱导BALB/c小鼠特异性体液和细胞免疫应答的增强效应.方法 利用PCR从尖锐湿疣组织中扩增HPV6b L1基因,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建野生型pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)并进行鉴定;同时,对HPV6b L1基因进行真核细胞偏好密码子优化,进一步通过重叠PCR的方法获得全长基因,构建密码子优化的重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)并进行鉴定.将6～8周龄雌性BALB/c小鼠分成4组,分别肌肉注射3次pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)、pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、pcDNA3.1(+)载体和PBS,间隔2周,每次剂量为150μg/鼠.分别于免疫前和免疫后每隔2周,收集血清,用间接ELISA检测血清igG抗体;并于第8周取小鼠脾细胞,采用乳酸脱氢酶释放法,按效应细胞与靶细胞之比(E:T)为5:1、10:1、20:1进行免疫小鼠特异性CTL杀伤活性检测.结果 成功构建了密码子优化的HPV6b L1重组质粒.小鼠免疫后血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间和次数的增加而升高.pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组血清IgG抗体在第8周达到高峰,与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、载体和PBS对照组相比差异均有统计学意义(t=18.138、t=29.140、t=30.840,P值均＜0.01);而pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)组与载体和PBS组比较差异也有统计学意义(t=20.072、t=22.457,P值均＜0.01).在特异性CTL杀伤实验中,当E:T分别为5:1、10:1、20:1时,pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组的脾细胞特异性CTL杀伤率明显高于pcDNA3.1(+)/HPV6bLl(wt)组(t=11.892、t=15.329、t=2.911,P值均＜0.05)、载体组(t=12.936、t=16.613、t=13.90l,P值均＜0.01)和PBS对照组(t=14.768、t=18.935、t=10.925,P值均＜0.01).结论 密码子优化的HPV6b L1 DNA可诱导BALB/c小鼠产生增强的特异性体液和细胞免疫应答.     

重组人乳头瘤病毒16型L1 VLP的初步纯化、鉴定及免疫效果的初步研究

目的 对昆虫细胞-杆状病毒系统表达的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型L1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)进行初步纯化研究,并在小鼠中检测纯化VLP的免疫原性.方法 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化方法纯化HPV16 LI VLP.对纯化得到的VLP分别进行蛋白印迹法、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及电镜鉴定.然后用VLP免疫6周龄BALB/c小鼠.将小鼠随机分成6组(3个剂量组、2个佐剂组和1个对照组),间隔2周免疫3次,3次剂量相同.取血分离血清,采用间接ELISA法检测抗HPV16 L1 VLP抗体滴度.结果 经蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化后,用SDS-PAGE鉴定纯化的HPV16 LI VLP,纯度达到90%.电镜观察可见完整的VLP颗粒.间接EUSA检测结果显示,剂量组及佐剂组小鼠血清中均可检测到特异性抗HPV16 L1 VLP抗体,且抗体滴度随针次和剂量的增加而增高.结论 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化法得到的HPV16 L1 VLP可用于免疫学初步研究.通过昆虫细胞表达产生的HPV16 LI VLP 具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强的体液免疫应答.     

重组四价人乳头瘤病毒16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗制剂工艺的优化

目的 考察不同制剂工艺流程下制备的重组四价人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗的抗原吸附效果、稳定性及免疫原性,根据实验结果筛选出最合适的制剂配方及工艺。方法  通过改变重组四价HPV疫苗的缓冲体系,以及氢氧化铝佐剂的含量、混合工艺、吸附方式与吸附条件,配制不同的实验疫苗,观察其外观,并分别进行蛋白质稳定性、抗原吸附率和小鼠体内半数有效剂量的检测。 结果 重组四价HPV疫苗原液与450 μg/ml氢氧化铝佐剂在pH6.5的组氨酸缓冲体系下混合后的实验疫苗,外观均一性良好,抗原蛋白稳定性最高,Tm=87.4 ℃,小鼠体内免疫原性较好;搅动吸附条件下的4型别HPV抗原吸附率明显高于静止吸附;铝佐剂和抗原蛋白的吸附与混合先后顺序,不同吸附比例、温度和时间对疫苗外观无显著影响,抗原吸附率均大于99.00%。结论 确定了重组四价HPV16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗合适的制剂工艺条件。     

合成肽重组疫苗的抗病毒效力

将编码保护性抗原决定簇的合成寡核苷酸插入合适的表位表达基因中能构成合成重组疫苗。本文报道了对表达流感病毒和曼氏血吸虫抗原决定簇的沙门菌疫苗株重组鞭毛的研究结果。将能诱导 T、B细胞免疫应答的 3个保守的流感病毒血凝素 (HA)和核蛋白 (NP)抗原决定簇表达在鞭毛上 ,并用不加任何佐剂的重组鞭毛鼻腔免疫小鼠。结果表明 ,疫苗能诱生特异性针对流感病毒的体液和细胞免疫应答 ,并能长期保护杂交株小鼠抵抗流感病毒的感染。老年小鼠也能获得抗感染的能力。为了研制人流感疫苗 ,应用了可被高加索人群人类白细胞抗原 (HLA)识别的抗原决定簇 ,并在移植了人外周血单个核细胞 (PBMC)的人 /鼠辐射嵌合型小鼠中评估疫苗。研究表明 ,攻击后疫苗接种小鼠能有效清除病毒 ,并能抵抗致死性感染。对于血吸虫病 ,将表示 9B-肽 1的 1 4个氨基酸残基肽表达在鞭毛上 ,在不加佐剂的情况下鼻腔免疫小鼠 ,获得 40 %的保护率。     

HPV16 E6/E7重组体DNA免疫对小鼠脾细胞分泌活性的影响

目的研究人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E6／E7蛋白与结核杆菌热休克蛋白70（HSP70）表达重组体DNA免疫对小鼠活化脾细胞分泌活性的影响。方法采用肌肉注射DNA的方法免疫小鼠。分离脾细胞。用ELISA检测细胞因子的表达水平及抗体的水平。用RT-PCR的方法检测细胞中细胞因子mRNA的水平。结果以HPV16E6／E7为基础的DNA免疫小鼠后，检测到的细胞因子IL-2，IFNγ的含量明显升高：与结核杆菌HSP70重组后。IL-2，IFNγ的含量较重组前明显升高。与结核杆菌HSP70重组后，IL-10及抗体水平没有明显变化。结论以HPV16E6／E7为基础的DNA免疫能增强小鼠的细胞免疫反应。与结核杆菌HSP70重组后能提高细胞免疫的效果，但对体液免疫几乎没有影响。     

人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用

目的建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗(HPV16 L2E6E7)酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控。方法用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性。结果建立了检测HPV16 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53~1 250 ng·m L-1内有很好的线性(R2>0.99)和回收率(90%~110%);特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰。结论建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段。     

重组毕赤酵母HBsAg诱导小鼠细胞免疫应答的研究

目的   研究毕赤酵母表达的重组HBsAg(Pichia-rHBsAg)在小鼠中诱导T细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性.   方法  以rHBsAg免疫雌性BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,并在体外以抗原/特异性多肽刺激.采用ELISA法测定抗原特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子,酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定CTL频数.   结果 由毕赤酵母表达的rHBsAg可在小鼠中诱导Th1和Th2型免疫应答;加铝佐剂的rHBsAg诱导IFN-γ的水平及CTL克隆明显高于无佐剂抗原;Pichia-rHBsAg刺激小鼠细胞免疫应答的水平强于酵母-rHBsAg,与中国仓鼠卵巢细胞-rHBsAg相仿.   结论   Pichia-rHBsAg可在BALB/c小鼠中诱导较强的细胞免疫应答.     

湖北株HPV_(16)E_7基因疫苗的构建及免疫性研究

用 Eco R 和 Hind 双酶切 PWR5 90 -1,所得湖北株 HPV1 6 E7片段克隆入真核表达载体 pcd3.1- ,构建了湖北株HPV1 6 E7基因疫苗 ,皮下注射 BALB/c近交系小鼠 ,体外应用酶联免疫吸附实验 ( Elisa)法和 MTT法分别检测了湖北株 HPV1 6 E7基因疫苗在体内产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

鼻粘膜免疫融合蛋白Hsp65-6×p277预防NOD小鼠1型糖尿病的发生

目的提高多肽p277的免疫原性,从而提高其对自身免疫性糖尿病的预防作用.方法将p277 6次重复与Hsp 65融合置于pET28a中构建重组Hsp 65-6×p277表达质粒.该重组质粒在大肠杆菌BL21中以高效可溶形式表达.依次通过细胞裂解、硫酸铵沉淀、双蒸水透析、DEAE纤维素52柱层析纯化获得目的蛋白.用纯化后的融合蛋白Hsp 65-6×p277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠.每月眼角取血,检测抗体和血糖浓度.结果初步药效学实验表明融合蛋白Hsp 65-6×p277可抑制NOD小鼠中1型糖尿病的发生.结论融合蛋白Hsp 65-6×p277有可能发展成为一种具有防治胰岛素依赖性糖尿病作用的疫苗.     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

EGFR/HER2联合多肽表位疫苗的构建及体液免疫学分析

构建以乙肝病毒核心抗原(HBcAg)为载体的带有1个EGFR和2个HER2的模拟B细胞表位多肽的融合表达质粒pET28a/HBcAg-△n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫BALB/c小鼠获得抗目的蛋白的抗体。采用PCR法将3个模拟表位插入HBc序列的第78～79位,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21(DE3)作宿主菌表达出融合蛋白HBHE,纯化后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。测序结果表明,重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确,ELISA检测到高滴度抗体。以HBcAg为载体的B表位被成功表达和纯化,获得高滴度的与3个B表位结合的抗体,为进一步研究HER家族成员联合多肽表位疫苗的广谱抗肿瘤作用奠定了基础。     

催化合成谷胱甘肽的基因工程菌的构建及表达

目的利用基因工程菌合成谷胱甘肽。方法克隆γ-谷氨酰转肽酶,构建重组质粒pET30a-GGT,乳糖诱导融合蛋白的表达,利用pET30a-GGT/E.coliBL21和pET32a-GSH-II/E.coliBL21分两步法合成γ-谷氨酰半胱氨酸与谷胱甘肽。结果工程菌的最佳乳糖诱导条件为:浓度3mmoL.L-1、时间6h、温度28℃。工程菌经最佳条件诱导后,γ-谷氨酰转肽酶的酶活大约是出发菌株E.coliDH5α的21倍,酶活力得到明显提高,谷胱甘肽的产量达到0.524g.L-1。结论成功地为今后利用基因工程菌催化合成谷胱甘肽寻找到一种新的方法 。     

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造，构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a—T1-GFP，重组质粒在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白His-T1-GFP，经组氨酸亲和层析纯化后，用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His—T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a—T1-GFP，融合蛋白His—T1-GFP在大肠杆菌EcoliB L21（DE3）中表达率为20％。经组氨酸亲和纯化，得到纯度达85％的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP，动物实验表明融合蛋白His—T1-GFP能够有效跨过血脑屏障，主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了-种新的穿膜肽-T1，为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

HPV6bL1-TpN15嵌合基因原核表达系统的构建

目的 分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和尖锐湿疣(cA)组织中扩增人乳头瘤病毒(HPV)6b型L1和TpN15基因,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因及其原核表达系统.方法 采用PCR分别从CA组织及Tp临床菌株中扩增HPV6b L1和TpN15基因片段,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)构建重组质粒pET32a(+)/HPV6b L1-TpN15,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达的融合蛋白用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白质印迹法分析鉴定.结果 HPV6b L1-TpN15融合蛋白在原核表达系统中得到了较高表达.结论 原核表达的HPV6bL1-TpN15融合蛋白具较强的抗原性.     

Enhanced protective efficacy and reduced viral load of foot-and-mouth disease DNA vaccine with co-stimulatory molecules as the molecular adjuvants

To improve efficacy of DNA vaccination, various approaches have been developed, including the use of plasmid expressing co-stimulatory molecules as molecular adjuvants. In this study, we investigated whether co-inoculation of a construct expressing either 4-1BBL or OX40L as the molecular adjuvant with FMDV DNA vaccine, pcD-VP1, can increase immune responses and protective efficacies. Compared to the group immunized with pcD-VP1 alone, the co-inoculation of either molecular adjuvant induced a higher ratio of IgG2a/IgG1, higher levels of expression of IFN-gamma in CD4(+) and CD8(+) T cells and antigen-specific CTL responses, and more importantly provided an enhanced protection against the live FMDV challenge in animals. Concurrently, 4-1BBL as the molecular adjuvant dramatically reduced the viral loads of FMDV in vivo after the challenge. Together, the results demonstrate that co-stimulatory molecules 4-1BBL and OX40L can enhance the antigen-specific cell-mediated responses elicited by VP1 DNA vaccine and provide an enhanced protective efficacy with the reduced viral loads.