不同冻存液冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株 HepG2的效果比较

目的筛选冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液。方法采用甘油和二甲基亚砜(DMSO)2种不同冻存保护剂,以4种不同比例的冻存液分别冻存慢病毒转染后肝癌细胞HepG2及未转染的HepG2细胞,并对上述细胞复苏后的存活率及增殖能力进行比较分析。结果采用甘油为冻存保护剂时,冻存液[DMEM∶胎牛血清(FBS)∶甘油]比例为0∶9∶1的转染后细胞存活率最高(P=0.001);未转染细胞存活率与冻存液比例无关(P=0.293)。采用DMSO为冻存保护剂时,转染后细胞存活率为0%;未转染细胞存活率在60%及以上,且与冻存液比例无关(P=0.487)。冻存液中血清含量越高,复苏后细胞的增殖能力越强(P<0.05)。结论冻存慢病毒转染后的稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液为90%FBS+10%甘油。     

以聚乙烯吡咯酮为保护剂液氮冻存犬恶丝虫微丝蚴成功

本文在比较使用三种低温保护剂的基础上,专一采用效果最好的14％聚乙烯吡咯酮(poly-vinylpyrrolidone,PVP)为低温保护剂,液氮冻存犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)微丝蚴再次获得成功。冻存方法为将含14％PVP的微丝蚴沉淀液,先置于一25℃冰箱中30min,后快速置于液氮     

光动力疗法诱导Hela细胞凋亡的实验研究

1 一般资料 1．1准备工作：细胞复苏、培养、传代、冻存：人宫颈癌细胞系Hela为贴壁细胞，从液氮中取出冻存的细胞后立即置于37℃水浴中融解。1000r／min离心5分钟，弃上清后加入RP—M11640培养基离心洗涤1次。加入含10％小牛血清的RP—M11640培养基5ml悬浮起细胞后置于25ml细胞培养瓶中，     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

人外周血造血干细胞低温保存方法的实验研究

目的：观察－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法中单用二甲基亚砜（DMSO）与DMSO加羟乙基淀粉（HES)两种浆存保护剂对人外周血造血干细胞体外冻存的效果。方法：对5例经Cs-3000Plus血细胞分离机分离所得的外周血单个核细胞分别加入10％DMSO和5％DMSO加6％HES冻存保护剂。并分别以－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法保存15d，以快速复温法复苏细胞，检测冻存前后细胞活率及有核细胞、CD34^ 细胞、粒单系集落形成单位（CFU－GM）、红系集落形成单位（CFU－E）回收率。结果：在－196℃程控降温冻存方法时，单用DMSO和DMSO加HES两组在细胞活率、有核细胞回收率、CD34^ 细胞回收率、CFU－E回收率方面差别无显著性意义；在－80℃直接冻存方法时，MDSO加HES组有核细胞回收率、CFU－E回收率高于单用DMSO组。结论：－196℃程控降温冻存时10％DMSO和5％DMSO加6％HES两种冻存保护剂均可有效应用于外周血造血干细胞保存；一80℃直接冻存方法适合5％DMSO加6％HES冻存保护剂，也可有效用于外周血造血干细胞保存。     

HL60细胞冻存复苏生物学特性对比分析

目的探讨不同冻存复苏条件对白血病细胞株HL60生物学特性的影响,并优化培养方法与条件。方法对比不同浓度DMSO冻存条件、不同复苏方法对复苏后细胞生物学特性的影响,并确定培养液血清最佳浓度。结果采用5%DMSO冻存防护效果好于其他组,改良后细胞的复苏存活率明显高于传统复苏方法。结论以5%DMSO作为HL60细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法,可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为HL60细胞常规培养的最适浓度。     

脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究

目的通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果,以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存,冻存前及冻存3、6及12个月后,应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞(MNC)计数,台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34 细胞计数。结果在-80℃冰箱冻存3个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后,脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性(P<0.05)。冻存12个月后,脐血各项指标较冻存前差异均有显著性,其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性(P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月,6个月后存在部分细胞损害,此时的脐血不适合作干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后,造血干细胞仍保存完好,适宜长期保存。     

龟蛇阿米巴冷冻保存

本文报道龟蛇阿米巴在含5％DMSO和10％小牛血清的RPMI1640培养液中,经长期冷冻保存后,其形态及生物学特性保持不变。     

细胞组织冻存方法的改进

体外细胞培养作为重要的实验细胞学手段在生命科学研究的众多领域中已广泛应用。目前,选择液氮作制冷源深低温保存肿瘤细胞已得到普遍认同。我们在传统方法基础上改进了细胞冻存方法,在实际应用中取得了满意效果,现将体会介绍如下。1　细胞冻存方法的改进以膀胱癌EJ细胞为例,人膀胱癌EJ细胞培养在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,取对数生长期的贴壁细胞,0.25%胰蛋白酶消化3～4min后,用上述培养液进行终止消化,计数细胞数,收集细胞悬液于10ml离心管内,1000r/min离心10min,弃上清,保留细胞。同时配制含10%的冻存保护剂二甲基亚砜(DMSO…     

成年大鼠神经干细胞的冷冻复苏及生物学特性观察

目的 建立成年大鼠神经干细胞冷冻复苏方法，观察冻存复苏后神经干细胞的活力及生物学特性。方法 采用10％BSA 8％DMSO做冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和免疫细胞化学方法观察冻存复苏后细胞的活力、形态、分化能力及特异性抗原表达。结果 不同的冻存时间、细胞代数对冻存后细胞的存活率没有明显影响；冻存复苏的神经干细胞不仅有较高的存活率，而且仍保持其原有的生物学特性。结论 成年大鼠神经干细胞的冻存并不影响其活力及原有的生物学特性。     

液氮冻存犬钩虫卵的研究

寄生虫的低温保存,目前国内外多应用于原虫和蠕虫幼虫的冻存,蠕虫虫卵的低温保存比较少见。本文对犬钩虫卵进行了液氮冻存的研究。材料和方法取犬钩虫阳性犬小肠内容物,水洗沉淀后,获得大量含4～8个卵细胞的犬钩虫卵。采用7.5％乙二醇(EG)和14％聚乙烯吡咯酮(PVP)两种低温保护剂,各分为两组:即一组在保护剂中加一滴吐温-80(tween-80);一组则不加。冷冻步骤为两步冷冻法,即先在-20℃冰箱中预冷30分钟后,快速浸入液氮(-196℃)中冻存。另有两管置于室     

原代大鼠肝细胞分离方法与冻存条件的优化

目的 :优化原代大鼠肝细胞 (PRH)分离方法与冻存条件。方法 :建立低浓度胶原酶原位循环灌流法分离肝细胞 ;分别采用含 2 %与l0 %DMSO的冻存液于 - 70℃或液氮中冻存PRH ,并比较各组冻存后PRH活力。结果 :1.该分离方法肝细胞产量为 1.5 84± 0 .5 2 5× 10 8/10 0g大鼠体重 ,存活率达 95 .2± 2 .9% ,肝细胞纯度 >95 % ,胶原酶用量减少为 4 .5mg/10 0 g大鼠体重。 2 .含 2 %DMSO冻存液于 - 70℃组与液氮组PRH存活率均可达 90 %～ 95 % ;ALB冻存 14d - 70℃组PRH明显高于液氮组与新鲜分离组 ,LDH值于冻存 7d的 - 70℃组与液氮组明显低于新鲜分离组 ,其它各组间均无显著差异。结论 :低浓度胶原酶原位循环灌流法为高效的PRH分离技术 ;含 2 %DMSO冻存液于 - 70℃可作为原代肝细胞冻存的理想条件。     

人骨髓基质细胞冻存技术的初步研究

目的　探索适合于人骨髓基质细胞 - 196℃冷冻保存条件和方法。方法　以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质细胞培养 ,传代后以不同浓度二甲亚砜 (DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存 ,2个月后复苏接种培养 ,对其存活率、贴壁率和体外成骨能力进行检测。结果　不同DMSO浓度保存细胞复苏后细胞的存活率从高到低依次为 10 %DMSO组、5 %DMSO组、15 %DMSO组、2 0 %DMSO组 ;在条件培养液中 2周形成多层结构 ,并出现细胞结节 ,碱性磷酸酶染色阳性 ;冻存时细胞浓度为每毫升 (5 .0～ 8.0 )× 10 6个细胞组复苏后细胞存活率高于每毫升 (1.0～2 .5 )× 10 6个细胞组。结论　 5 % - 10 %DMSO浓度适合于骨髓基质细胞的长期保存 ,高浓度组骨髓基质细胞的冻存效果优于低浓度组。     

液氮深冻保存钩体菌株方法的探讨

目的 用液氮深冻保存钩体菌株方法替代钩体菌株常规传代保存方法.方法 采用15群15型钩体标准菌株和本实验室从鼠类及患者体内分离的6型16株菌株,接种在10%兔血清K0rthodf培养基中28℃培养,采用液氮深冻保存方法,冻存3～36个月后,以37℃水浴复苏.10%兔血清Korthodf培养基中28℃培养,用暗视野显微镜观察其复苏情况;同时,比较加入甘油-生理盐水冻存液的效果.结果 液氮深冻保存方法菌株复苏、存活率高,经过多种条件分别冻存3～36个月后,结果差异无统计学意义.结论 液氮深冻保存钩体菌株,复苏率高,保存时间长,具有保持其病原性和抗原性、减少污染等优点.     

人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术

目的 研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术，探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性。方法 新鲜脐带42条，脐静脉内灌注消化酶消化，获得内皮细胞：以含20％的胎牛血清M199液进行培养。采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度：内皮细胞加入含10％DMSO冷冻保存液，置于液氮进行保存，复苏后进行锥虫蓝试验，四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在95％以上。复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异。冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高，但无统计学意义。结论 脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力，可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源。     

体外培养细胞的长期冷冻保存

在体外细胞培养过程中,如按常规法传代保种,不仅耗时费力,且能引起细胞性状发生改变,同时又易受微生物或细胞之间的感染。为了避免在细胞培养过程中常会遇到的这些问题,1959年Hauschka等曾应用低温(-78℃)保存法冻存82种肿瘤和正常细胞,初获成效。但细胞经长期冻存后存活率很低,仅2～3％。近年来,由于冷冻技术的发展,普遍采用深低温(-196℃)的液氮冻存法,大大提高了细胞的存活率。据报道,若干细胞系经液氮冻存1～2年后的存活率仍可达     

苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的实验研究

目的 应用苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞,观察苦参碱对大规模低温冻存人胎肝细胞功能的影响。方法 改良肝细胞获取方法分离人胎肝细胞,经过1h预培养后。将5种不同浓度（1×107,2.5×107,5×107,7.5×107,10×107)的胎肝细胞以6mg/L苦参碱+5%DMSO冻存保护液置于骨髓干细胞冻存袋在液氮中冷冻保存1个月。1个月后复苏,进行活率、形态学及功能检测。结果 五种不同浓度的细胞冻存一月后,细胞浓度为2.5×107/ml组复苏后存活率与其余四组相比差异有统计学意义（P<0.05）且明显高于其余四组。复苏后细胞存活率和24h贴壁率分别为73%、69%,经过短期培养后,细胞功能逐渐恢复。结论 (1苦参碱对低温冻存之人胎肝细胞有保护作用,与二甲基亚砜联合使用可降低后者的浓度;（2）以5%DMSO+6mg/L苦参碱作为冻存保护剂,细胞浓度在2.5×107冻存效果最佳。该大规模冻存方法基本上可以满足生物人工肝肝细胞应用的需求。     

-80℃冻存外周血干细胞21例分析

目的：探索一种操作简单、干细胞回收率和存活率高、成本低廉的外周血浆存方法。方法：采用终浓度为5％二甲基亚砜（DMSO），3％羟乙基淀粉（HES）和4％人血白蛋白（HSA）的干细胞保护剂直接－80℃冰箱冰存外周血干细胞，并检测不同时相点（1、3、6、9、12个月）外周血干细胞的细胞活性，单个核细胞（MNC）和CFU－GM、CD34^ 细胞的回收率。结果：随着保存时间的延长，观察到12个月时，冻存干细胞的细胞活性、MNC回收率和CD34^ 细胞回收率分别为86．46％、88．58％、87．65％，与冻存1个月相比无统计学差异（P＞0．05），足以保障干细胞移植后造血重建的成功。结论：5％DMSO，3％HES和4％HAS作为干细胞冷冻保护剂直接－80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种简便、实用、安全、可靠、成本低的外周血干细胞冻存方法，具有广泛的临床推广价值。     

不同保护剂冻存弓形虫速殖子的观察

传统弓形虫保存一般采用小鼠传代法,70年代以来,我国开展了寄生虫低温保存的研究,常用的低温冷冻保护剂有甘油、乙二醇（EG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、经乙基淀粉、二甲基亚砜（DMSO）等。为了观察不同保护剂的效果,我们将弓形虫急性感染小鼠的腹水加入四组不同的低温保护剂后放液氮冻存,进行保种试验观察。     

直接用于输注的临床级细胞冻存保护剂的动物体内外安全性评价

目的 探索研究一种安全有效的可以直接用于输注的临床级细胞冻存保护剂.方法 采集50份脐带血, 使用羟乙基淀粉沉淀法分离得到脐血有核细胞, 加入5种不同浓度的冻存保护剂 (DMSO、人血白蛋白、勃脉力A) , 于液氮中冻存6个月, 检测并比较冻存前后有核细胞、CD34+细胞、细胞集落形成单位、回收率和台盼蓝拒染率;将不同浓度的冻存保护剂经尾静脉注射到小鼠体内, 评估其安全性.结果 A组 (10%DMSO+5%人血白蛋白+勃脉力A) 与C组 (7.5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A) 台盼蓝拒染率、有核细胞回收率、CD34+细胞回收率和集落形成单位回收率无统计学差异 (P>0.05) 且高于其它3组 (P<0.05) , 但A组的肝脏毒性高于其它组 (P<0.05) .结论 7.5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A是一种安全有效的冻存保护剂.