人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6.方法采用基因重组技术,用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoR I酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3kb和1.7kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5kb和O.5kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础.     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

胶质细胞源性神经营养因子基因真核荧光表达载体的构建

目的: 构建可在真核细胞中表达胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic growth factor,GDNF)的荧光表达载体。方法: 采用聚合酶链反应(PCR)扩增GDNF基因,将GDNFDNA克隆到pEGFP-N₁质粒,通过抗性基因筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定。结果: 酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与Genebank报道的GDNF基因序列一致。结论: 成功构建了GDNF荧光真核表达载体,为从分子水平开展GDNF转基因相关研究奠定了基础。     

MAGE-E1a荧光真核表达载体的构建

目的：构建MAGE-Ela与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体，为研究肿瘤疫苗中树突状细胞的作用奠定基础．方法：应用基因重组技术，将反转录PCR得到的MAGE-Ela基因克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中，用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子经SalⅠ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定．结果：MAGE-Ela基因成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP-N3中，获得MAGE-E1a／pEGEP-N3重组质粒．结论：MAGE-E1a基因克隆入pEGFP-N3质粒，成功构建MAGE-E1a／pEGFP-N3荧光真核表达载体，解决了MAGE-E1a基因转染的定位问题，为研究肿瘤疫苗奠定了基础。     

大鼠谷氨酰胺酶反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 :构建大鼠谷氨酰胺酶 (GA)反义真核表达载体。　方法 :采用分子克隆技术将rGAcDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。　结果 :EcoRⅠ和HinDⅢ双酶切后 ,反义重组基因为 0 .2 8kb和 5 .4kb两条带 ,与理论计算相符。　结论 :成功构建了大鼠GA反义真核表达载体 ,为肿瘤细胞的GA反义基因治疗研究创造条件     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

Gi蛋白真核表达载体的构建及表达检测

目的:克隆抑制腺苷酸环化酶G蛋白(Gi蛋白)3个亚基α、β和γ基因,构建pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,完成其在真核细胞中的表达检测.方法:培养肝癌细胞HepG2,提取总RNA后反转录成cDNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增α、β和γ的编码基因,在α亚基两端添加酶切位点,在β和γ亚基两端分别添加酶切位点和连接肽,经酶切和连接得到Giα1和Giβ1-γ2,再将Giα1和Giβ1-γ2基因分别构建到荧光蛋白报告载体pEYFP-N1和pECFP-C1中,利用脂质体法将真核表达载体转染到肝癌细胞中,激光共聚焦显微镜观察分析其表达活性.结果:PCR扩增获得Gi蛋白α、β和γ亚基的编码基因,在两端添加酶切位点和连接肽后获得的Giα1和Giβ1-γ2基因,成功构建了pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,并在肝癌细胞中实现其真核细胞表达.结论:成功构建Gi蛋白的真核表达载体,并鉴定其在活细胞中具有表达活性.     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

人Smurf1 shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建三条人Smurf1 shRNA真核表达载体,以逆转TGF-β1诱导人HK-2细胞转分化。方法：针对人Smurf1基因设计,采用体外转录生物合成的特异性短发夹RNA（shRNA）双链分子,对重组质粒（命名为pSilencer-S1 shRNA、pSilencer-S2 shRNA、pSilencer-S3 shRNA）进行1%琼脂糖凝胶电泳,初步鉴定及测序鉴定。结果：1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定证实Smurf1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入序列测序结果与合成序列结果一致。结论：Smurf1 pSilencer-S1 shRNA、pSilencer-S2 shRNA、pSilencer-S3 shRNA真核表达载体构建成功。     

人PD-L1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的稳定转染

目的构建含有人PD-L1基因的真核表达载体,并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系。方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（Xho1和EcoR1）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系,通过流式细胞术、RT-PCR及Westernblot分析PD-L1的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1,建立了稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定转染该分子的HEK293细胞系。     

人TLT-2真核表达载体的构建及其在L929细胞株中的稳定转染

目的构建含有人TLT-2基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达TLT-2分子的L929转基因细胞株。方法运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从健康人外周血单个核细胞（PBMC）的cDNA文库获得全长TLT-2基因,经过双酶切（XhoI和EcoRI）装入逆转录病毒表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选,流式细胞术、RT-PCR及Western blot鉴定TLT-2分子的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/hTLT-2,建立了稳定转染TLT-2目的基因的L929细胞株。结论成功构建了TLT-2真核表达载体并获得了稳定转染该分子的转基因细胞,为进一步研究人TLT-2分子的生物学功能提供了物质基础。     

RON基因反义核酸真核表达载体的构建策略

目的 构建RON基因跨膜区段(RONm)的反义核酸真核表达载体。方法 用RT-PCR技术，从人肺癌细胞提取的总RNA克隆RONm eDNA序列。然后酶切鉴定与测序分析得到RONm的T载体，再将RONm反向插入peDNA3．1 中，酶切鉴定得到RONm反义真核表达载体。结果 用RT-PCR亚克隆RONm，测序结果与GenBank的RONm相应序列(X70040)一致，阅读框无改变。构建出正确的RONm反义真核表达载体。结论 成功构建RONm反义核酸真核表达载体，为进一步将RON基因反义核酸作为一种肺癌基因治疗方法的研究打下了分子生物学基础。     

人促血管生成素-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人促血管生成素-2(Ang-2)反义真核表达载体。方法应用基因重组技术将Ang-2 cDNA反向克隆到真核表达载体pECFP-N1中。结果XhoⅡ、BamhⅠ双酶切后．反义重组基因为5．4kb和0．726kb两条带。与理论计算相符。结论成功构建人Ang-2真核表达载体，为肿瘤细胞的Ang-2反义基因治疗研究创造了条件。     

人HSP 40基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人热休克蛋白40(HSP40)的2种同源物HDJ-1和HDJ-2基因真核表达载体,观察其在人成神经细胞瘤细胞株(SK-N-SH)中的表达.方法 从流产胚胎脑组织中抽提总RNA,RT-PCR扩增HDJ-1和HDJ-2 cDNA,经限制性内切酶双酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)和pEGFP-N1质粒中.HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对,序列正确的重组质粒用脂质体转染SK-N-SH细胞, Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况.结果 HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致.Western blot证实pcDNA3.1(+)/HDJ-1转染SK-N-SH细胞24 h后有HDJ-1的过表达,至少持续72 h;pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞有HDJ-1/GFP和HDJ-2/GFP融合蛋白的表达,至少持续72 h.荧光显微镜观察到pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达.结论 本实验成功构建pcDNA3.1(+)/HDJ-1、pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2真核表达质粒,并在SK-N-SH细胞中表达.