膜联蛋白A5真核表达质粒的构建

目的:构建在哺乳动物细胞中表达的膜联蛋白A5(anxA5)的重组质粒.方法:Trizol法从人胎盘中抽提细胞总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板,扩增膜联蛋白A5的基因序列,引入酶切位点XhoI和BamHI.将真核表达载体pEGFP-N1和anxA5的PCR产物分别双酶切后用T4连接酶连接,转化大肠杆菌后抽质粒,测序鉴定.结果:重组质粒测序后,与genebank中anxA5的mRNA进行比对,证明anxA5基因序列正确,质粒构建成功.结论:成功构建了pEGFP-anxA5重组质粒,为研究膜联蛋白A5的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础.     

人WAF1基因表达质粒的构建

目的：克隆人ＷＡＦ１基因,构建成ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链反应从Ｈｅｌａ细胞中扩增人ＷＡＦ１基因,并克隆到ｐｃＤＮＡ３真核克隆载体中。结果：从Ｈｅｌａ细胞扩增的人ＷＡＦ１基因克隆至真核克隆表达载体ｐｃＤＮＡ３中,经ＤＮＡ直接测序,获得了ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３重组质粒。结论：成功地构建人ＷＡＦ１表达质粒ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３,为进一步研究ＷＡＦ１基因表达及生物学效应     

人单核细胞趋化蛋白—1融合表达质粒的构建

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ构建人单核细胞趋化蛋白－１融合表达质粒ＰＧＴ－ＭＣＰ－１,方法：采用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ重组技术,结果：将编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）基因克隆至融合表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ ,ＤＮＡ测序证实正确。结论：获得融合表达的质粒ＰＧＴ－ＭＣＰ－１,为进一步研究ＭＣＰ－１的同效表达奠定了基础。     

人TGFβ1cDNA高表达重组质粒的构建

目的为了得到基因工程制备的人重组TGFβ1,构建人TGFβ;cDNA高表达重组质粒。方法从人血小板中提取总RNA,经RT－PCR得到TGFβ;cDNA基因,并克隆到表达质粒pBLMVL2中,构建了在PL启动控制基因表达质粒pBLMVL2－TGFβ;,使其在大肠杆菌中进行温敏诱导表达。结果RT－PCR得到的TGFβcDNA经DNA序列分析与文献报道一致,pBLMVL2－TGFβ1在大肠杆菌中表达产物人重组TGFβ1经还原型SDS－PAGE电泳,呈一条蛋白条带,分子量12．5kd,表达产物约占全菌蛋白20％。结论构建的重组质粒pBLMVL2－TGFβ1能高表达人重组TGFβ1。     

真核表达质粒pVAX1的应用

从20世纪90年代DNA疫苗诞生以来,其在医学领域已取得长足的进步和发展,它的出现为预防感染性疾病的发生提供了一种新思维、新方法。但是,目前在DNA疫苗中所应用的载体质粒仅局限于实验室研究和动物实验,如何使DNA疫苗应用于人体实验,最终走向临床研究,是摆在当今广大科研人员面前的关键难题。pVAX1的出现为解决这一难题提供了可能,它是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

VEGF-C真核表达质粒的构建及其真核表达

目的　研究人血管内皮生长因子 C(VEGF- C)基因功能片段的表达功能及表达活性。方法　以前期从人舌癌克隆得到的 VEGF- C功能片段 c DNA和真核表达质粒 pc DNA3.1( )构建重组质粒 ,以阳离子脂质体转染法将其导入舌鳞癌细胞 Tca8113,并检测其表达、分泌功能及体外激活能力。结果　通过将长度约为 110 0 bp的VEGF- C功能片段插入 pc DNA3.1( )的 Eco R 和 Xho 酶切位点之间 ,成功构建出 pc DNA3.1( ) - VEGF- C重组质粒 ,该质粒转染 Tca8113细胞后得到 VEGF- C高表达的舌癌细胞 Vc Tca,转染后的细胞可表达相对分子质量为 5 3× 10 3和 2 9× 10 3的 VEGF- C分子 ,在细胞培养液中可检测到相对分子质量为 2 9× 10 3的 VEGF- C片断。结论　构建的 VEGF- C重组质粒可在真核细胞实现表达 ,并能被分泌和激活     

介导人血红素加氧酶-1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建含人血红素加氧酶-1(HO-1)基因的重组pcDNA3.1质粒并进行鉴定.方法:利用分子生物学技术,从人肝脏标本中提取出RNA,进行RT-PCR后,做TA克隆,成功获得pMD/19-HO-1质粒,采用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ从pMD/19-HO-1质粒中将目的基因片段切出,克隆到质粒pcDNA3.1的相应酶切位点中,构建重组质粒pcDNA3.1-HO-1,采用限制性酶切、DNA测序鉴定,将构建好的质粒瞬时转染ECV304细胞株,Western blot测定HO-1表达.结果:酶切、测序鉴定证实插入位点及方向与预期完全一致,测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致,瞬时转染细胞后HO-1蛋白表达明显增高.结论:成功构建了含人血红素加氧酶-1基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在糖尿病血管并发症中的作用奠定基础.     

人结肠癌细胞Dickkopf-1的表达水平及意义

目的检测六株结肠癌细胞中Dickkopf-1（DKK1）的表达并探讨其意义。方法在6株结肠癌细胞（SW480、SW620、HT29、
LS174T、LOVO、HCT116）分别应用qPCR方法检测DKK1的mRNA表达水平。用Western blot方法和细胞免疫组化方法检测
DKK1的蛋白表达情况。结果荧光定量分析显示,DKK1在HT29、HCT116中的表达高于其他四株细胞（P<0.05）;Western blot
显示,DKK1在HCT116、HT29中的表达同样高于其他四株细胞;细胞免疫组化染色显示,DKK1在六株结肠癌细胞株中呈阳性
表达。结论DKK1在6株人结肠癌细胞系中的表达具有差异性。
     

人神经生长因子β基因克隆及其真核表达载体的构建

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经营养因子家族中最早被发现,也是迄今为止研究得最为清楚的细胞生长因子.研究表明,NGF能够维持神经元的生长、发育、分化、存活.此外,NGF还参与神经损伤的再生与修复,促进受损神经元的修复和再生[1].然而,NGF属生物大分子,不能通过血脑屏障,限制了其应用.基因治疗是目前解决NGF给药途径问题最有希望的方案.本研究将克隆人NGF-β基因编码序列并构建其真核表达载体,为进一步应用其开展帕金森病(Parkinson's dis-ease,PD)的基因治疗研究奠定基础.     

LHR真核表达载体构建及表达

目的构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法KpnI／Hpa工双酶切LHR-cDNA质粒载体获得目的基因,定向克隆构建pcDNA3．1（4-）真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,G418筛选,RT-PCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHRMCF-7细胞。结果重组质粒pcDNA3．1（4-）-LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3．1（4-）-LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RT-PCR检测MCF-7细胞LHRmRNA,MCF-7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF-7细胞高表达LHR。结论构建并转染pcDNA3．1（4-）-LHR真核表达载体,在MCF-7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 体外构建携带报告基因胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)的重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法 采用密度梯度离心法分离获得BMSCs,进行细胞免疫化学鉴定;应用PCR技术获得HSV1-TK、内部核糖体进入位点(IRES)、BDNF的cDNA序列,酶切后依次插入到pcDNA3.1的多克隆位点(MSC)中,酶切和序列分析鉴定;脂质体介导重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs,RT-PCR和Western blot检测其目的 基因表达.结果 重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF经酶切和序列分析鉴定与预期设计一致;RT-PCR和Western blot检测证实TK和BDNF在IRES介导下可同时表达.结论 成功构建重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF并在BMSCs中有效表达,为下一步核素活体示踪转基因BMSCs治疗脑血管疾病奠定了实验基础.     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

人pcDNA3.1(+)-Cav-1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1 (+)-Cav-1真核表达载体,建立稳定转染pcCav-1的6-10B细胞系(6-10B-Cav-1).方法 提取5-8F细胞总RNA,利用RT-PCR获取caveolin-1(Cav-1)开放读码框(Open reading frame,ORF)序列构建Cav- 1/TA亚克隆载体,再将双酶切后的目的片段连入pcDNA3.1(+)真核表达载体并转染6-10B细胞.结果 RT-PCR扩增Cav-1基因ORF序列在783 bp附近见目的条带;质粒酶切鉴定及菌落PCR鉴定分别在783 bp及346 bp附近见目的条带;转染6-10B细胞后,转染组与对照组相比,Cav-1在mRNA水平表达差异具有统计学意义(P =0.027),在蛋白质水平前者比后者高出2倍以上.结论 人Cav-1重组真核表达载体pcDNA3.1( +)-Cav-1构建成功并获得稳定表达Cav -1的6-10B细胞,为进一步检测C av -1在鼻咽癌转移过程的作用奠定基础.     

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶...     

小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体的构建、表达及意义

目的 构建小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达,为进一步探讨CXCL14对脂肪细胞因子、氧化应激及胰岛素信号转导通路的影响提供工具.方法 从C57/BL胚鼠肝脏组织中抽提RNA,RT-PCR扩增CX-CL14基因片段,并将其插入pcDNA3.1进行测序,鉴定正确构建pcDNA3.1/CXCL14后转染293T细胞,用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白质水平分别检测CXCL14的表达情况.结果 重构质粒经PCR、限制性核酸内切酶Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切以及DNA序列分析鉴定,表明真核表达载体构建正确;以脂质体法转染293T细胞后,RT-PCR、Western blot能检测到目的蛋白表达.结论 成功构建了小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体并能在真核细胞中进行表达.