耐STI571的K562细胞株的建立及生物学特性考察

目的：建立1株耐STI571的K562细胞,并对其生物学特性进行研究分析,探讨耐药机理。方法：通过递增STI571药物浓度的方法,成功建立1株耐STI571人白血病细胞株K562/R,并采用RT-PCR、Western-blot、免疫组化、基因测序等生物学手段对其进行耐药机理进行分析。结果：K562/R细胞株在STI571浓度高达1μmol/L水平,仍能稳定生长,繁殖旺盛。K562/R细胞株耐STI57程度较亲代K562细胞多达235倍,该耐药细胞株对HHT﹑VCR﹑DNR具有不同程度的交叉耐药性,与亲代K562细胞比较差异有统计学意义（P〈0.05）。与亲代敏感株K562细胞相比,其BCR-ABL基因表达上调,BCR-ABL蛋白及其激酶过度表达。结论：成功建立耐STI571人白血病细胞株K562/R,并对其生物学特性的研究,为STI571耐药机制的进一步深入研究和抗耐药抑制剂的筛选提供了有效的平台。     

人骨髓成骨细胞体外培养

目的 研究人骨髓基质干细胞体外培养及其成骨特性，为骨组织工程学研究提供成骨种子细胞。方法 以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质干细胞培养，传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸纳和维生素C的条件培养基进行培养，用倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、四环素荧光标记等方法对所培养的细胞进行生物学特性研究。结果 接种细胞4d即可传代，在条件培养液中2周形成多层结构，并出现黑色结节，ALP染色阳性，结节四环素荧光标记、钙染色阳性，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈黄褐色。结论 采用本法在体外培养的人成骨细胞生长良好，并具有成骨细胞形态特征和生物学特性，可做为临床所需的成骨种子细胞来源，为骨组织工程学研究奠定了实验基础。     

兔骨髓基质干细胞的分离生长及冻存技术研究

目的：建立兔骨髓基质干细胞(MSC)体外分离、培养、增殖、冻存的方法，以及探讨其生物学特性。方法：抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。观察MSC的生长特性，测定其贴壁率及第3、8、13、18代的生长曲线，并评价其生物学特性。MSC在12．5％DMSO条件下经液氮或-60℃冻存复苏，测其成活率。结果：MSC为贴壁生长，以均一的梭形的成纤维细胞样生长，贴壁及增殖能力强，所测各代的生长曲线呈相似的S型，倍增时间约为35h。MSC需液氮保存，短期也可-60℃冰箱保存。结论：获得的兔MSC生长旺盛、增殖能力强，其分离、培养、纯化、增殖、冻存方法是可行的，可较长时间稳定地培养增殖、冻存，传代的MSC可保持其原代的生物学特性。MSC将是组织工程理想的种子细胞。     

TIF3转基因CHO和COS7细胞株的构建与鉴定

目的：TIF3（Mouse Translation Initiation Facfor 3)是从镉转化BALB／c-3T3细胞中克隆出来的新基因，其在基因文库（GenBank)的新添编号为AF271072。为了对该基因的生物学功能进行研究，构建了TIF3转基因CHO和COS7细胞株并作了鉴定。方法：采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法，以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体，构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株；应用Western Blot技术对转基因表达产物进行分析与鉴定。实验设计分无转染组（空白对照）、载体转染组（载体对照）和目的基因转染组（载体＋TIF3cDNA)。结果：结果显示，无论在CHO细胞还是COS细胞，经转染和G418筛选后,无转染组的细胞100％死亡，而载体转染组和TIF3cDNA转染组的细胞形成较锪细胞集落。提示克隆化基因的细胞转染及G418筛选效果良好。经Western Blot分析与鉴定，在7株转染和经G418反复筛选的CHO细胞株中，有3株具有高效稳定表达约36kDa的TIF3编码蛋白质；在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞株中有2株也具有高效稳定的TIF3编码蛋白质表达，而无转染组和载体对照组的CHO和COS7细胞均缺乏此蛋白质表达。结论：本研究成功地构建了3株TIF3转基因CHO细胞株和2株TIF3转基因COS7细胞株。这两类TIF3转基因哺乳动物细胞稳定表达系统的建立，对今后的镉化物相关癌基因的发现及其生物学功能的研究具有重要的应用价值。     

周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立

摘要:目的　将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Bm-CPI）基因的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞（Hela细胞）获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法　将成功构建的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果　重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞后,d 14可见G418抗性细胞株开始形成。G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带。结论　实验证实pcDNA3.1（+）-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。     

细胞色素P450 1A1-Wt和Asn461、Vla462真核表达载体的构建及人胚肺成纤维细胞转染

目的构建能够高效表达细胞色素P450 1A1（CYP 1A1）蛋白的细胞株，分析不同基因型蛋白表达的差异。方法首先将已经建立的T载体中CYP1A1-Wt和Asn^461、Val^462的CYP1A1片断重组至pBABE-neo载体上，转染入人胚肺成纤维细胞（HLF），G418筛选获得阳性细胞，Western-Blot检测CYP1A1蛋白的表达，观察细胞形态，生长曲线，恶变性等生物学特性的改变。结果CYP1A1野生型、变异型转染的HLF细胞均能高效表达CYP1A1蛋白，其生物学特性与正常细胞无显著差异，也不属于恶性细胞。结论通过细胞转染和筛选获得了表达CYP1A1蛋白的细胞株。     

空间环境对13株微生物生物学特性的影响

目的研究空间条件对13株微生物生物学特性的影响。方法可能影响航天员身体健康及降解空间材料的13株微生物，包括细菌、真菌、放线菌，经搭载7d后，对它们的一些生物学特性进行初步研究。结果空间条件下菌株的存活增长率均有明显提高，普遍生长较快，多数菌株产生色素；形态特征也有不同程度的变化；某些菌株对个别药物的抗性有所减弱，对多数药物的抗性不变。结论微生物在空间条件下繁殖能力增强，搭载后生长加快，形态分化提前，对药物的遗传抗性基本稳定。     

Survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7 survivin及HSP70表达的影响

目的探讨survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7survivin、HSP70表达的影响。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF7,将已构建的真核表达载体(pIRES2-EGFP-survivin siRNA、pIRES2-EGFP-HSP70)用脂质体介导转染MCF7细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过western-blot、RT-PCR检测转染后细胞中HSP70蛋白、survivin蛋白及survivinmRNA表达的变化。结果转染空载体与转染真核表达载体的乳腺癌细胞株MCF7于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,证实转染成功。转染真核表达载体的MCF7细胞与转染空载体的MCF7细胞和未转染的MCF7细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高。结论 survivin siRNA能有效抑制MCF7细胞内源survivin基因的表达,HSP70能上调MCF7细胞HSP70蛋白的表达,为进一步深入研究survivin siRNA、HSP70双基因对乳腺癌细胞株MCF7生物学特性的影响奠定实验基础。     

兔关节软骨细胞的体外培养及鉴定

目的：观察并鉴定体外单层培养的兔关节软骨细胞，分析其生物学特性。方法：取3周龄健康新西兰兔双侧膝关节及股骨头软骨，以机械分离与酶阶段消化分离相结合的方法获取软骨细胞，以DMEM高糖型培养基培养，待细胞达80％～90％融合时，以胰蛋白酶结合EDTA消化传代。逐日于倒置显微镜下观察和比较细胞形态，以四唑盐比色法绘制细胞生长曲线，分析细胞分化与生长能力，并采用组织学染色和ELISA的方法鉴定软骨细胞。结果：原代培养的兔关节软骨细胞约48～72h贴壁，细胞形态多为小的梭形、纺锤形或三角形。传代细胞贴壁时间缩短，随传代次数增加，细胞形态逐渐向长梭形发展，而第1～3代细胞的胞形、生长与分化无显著变化。生长曲线显示，软骨细胞传代后经历典型的潜伏期、对数生长期和停滞期。H、E．染色、番红O染色及甲苯氨蓝染色细胞核被染成相应的蓝紫色、红色和蓝色，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，细胞质被染成棕黄色，细胞核基本不着色。结论：成功进行了兔关节软骨细胞的体外培养，并发现体外单层培养的兔关节软骨细胞有去分化的趋势，而其第1～3代细胞生物学特性相对稳定，适合软骨组织工程研究之用。     

戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞及其稳定表达

目的 将戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞,建立能稳定表达ORF3蛋白(pORF3)的细胞株.方法 将ORF3基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-ORF3.电穿孔法将其导入HeLa细胞中,G418筛选得到稳定抗性的细胞株,并用RT-PCR和Western印迹法分别从mRNA水平和蛋白水平检测ORF3的表达.结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3-ORF3,并筛选获得能稳定表达pORF3蛋白的HeLa细胞株.结论 pORF3蛋白能够在HeLa细胞中稳定表达,为进一步研究其生物学功能奠定了实验基础.