脂多糖结合蛋白/CD14结合位点的初步定位

目的 应用噬菌体随机12肽库、DNAStar分析软件、亲和实验及竞争抑制实验初步定位脂多糖结合蛋白(1ipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14的结合位点.方法 以CD14为筛选分子,联合应用噬菌体肽库展示技术、噬菌体ELISA鉴定、LBP竞争抑制实验及DNA测序推导LBP/CD14结合位点的展示肽序列,采用DNAStar分析软件比对所获展示肽序列与LBP一级结构,初步定位LBP/CD14结合位点并人工合成其模拟肽.采用ELISA检测该模拟肽与CD14的亲和力及与LBP的竞争抑制活性.结果 DNAStar比对结果表明,经噬菌体肽库筛选获得的8条展示肽氨坫酸序列与LBP第252～263位氨基酸有一定相似性.LBP第252～263位氨基酸具有结合位点的特性,即有良好的亲水性、可及性、可塑性及抗原性,该部位可能是LBP/CD14的结合位点.体外活性实验表明,模拟肽FHRNHRSPVTLL可与CD14有良好的亲和力,有较强的与LBP竞争结合CD14的活性.结论 LBP第252～263位氨基酸的模拟肽FHRNHRSPVTLL与CD14有良好的亲和力及有较强的与LBP竞争结合CD14的活性,具有LBP/CD14结合位点的生物学特性,LBP/CD14结合位点初步定位在该区域.     

三条脂多糖结合蛋白/CD14结合位点模拟肽体外抗内毒素活性的比较研究

目的 比较三条LBP/CD14结合位点模拟肽体外抑制内毒素性炎症反应的生物学活性.方法 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测模拟肽与CD1l4的亲和力及与脂多糖结合蛋白(LBP)的竞争性抑制活性.将佛波脂(PMA)诱导成熟的U937细胞与内毒索共培养,并予以模拟肽干预,采用RT-PCR检测模拟肽对U937细胞TNF-α基因表达的影响.将大鼠肺泡巨噬细胞(AMs)与荧光标记内毒素(FITC-LPS)共培养,并予以模拟肽干预,采用荧光显微镜观测模拟肽对内毒素(LPS)与AMs结合的影响.结果 1号模拟肽(FHRWPTWPLPSP,10 μg/mL)与CD14的亲和力显著高于2号和3号模拟肽(20.3±4.1比11.8±2.4和13.7±3.3,P＜0.01或P＜0.05),1号模拟肽(10 μg/mL)对LBP的竞争性抑制活性也显著高于2号和3号模拟肽[(57.2±11.2)%比(39.4±9.7)%和(37.9±8.3)%,P均＜0.01].三条模拟肽(10μg/mL)均可从基因水平显著抑制LPS诱导U937细胞产生TNF-α(P＜0.01或P＜0.05),1号模拟肽的抑制作用显著强于2号和3号模拟肽(0.239±0.053比0.406±0.112和0.493±0.121,P＜0.01).1号模拟肽能显著抑制LPS与AMs结合(2 157±514比2 763±453,P＜0.01).结论 1号模拟肽(FHRWPTWPLPSP)有较高的CD14亲和力及LBP竞争性抑制活性,具有潜在的抗内毒素性炎症反应的作用.     

能结合HCV E2蛋白的人CD81模拟肽的筛选与活性鉴定

目的用CD81单克隆抗体筛选噬菌体随机展示十二肽库,以期得到可模拟人CD81功能位点、能抑制HCVE2与其受体—人CD81分子结合的小肽。方法用CD81单抗从噬菌体随机展示十二肽库中筛选人CD81模拟肽,用ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;以阳性噬菌体免疫BALB/c小鼠,分析小鼠免疫血清对阳性噬菌体与HCVE2结合的阻断作用;以HCVE2蛋白包被酶标板,检测阳性噬菌体对HCVE2与人CD81分子结合的抑制作用。结果对十二肽库进行3轮筛选后,经ELISA和DNA测序,鉴定出3个(C4,C13和C16)阳性克隆,与人CD81无同源序列。阳性噬菌体克隆C16免疫小鼠血清能阻断该克隆与HCVE2的结合。C16克隆能以剂量依赖的方式竞争性抑制HCVE2蛋白与人CD81的结合。结论用人CD81单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选出的阳性噬菌体克隆所编码的小肽在功能上能模拟人CD81与HCVE2的结合活性,能竞争性抑制HCVE2与人CD81分子的结合,在抗HCV药物及疫苗研究中具有潜在应用价值。     

人源脂多糖结合蛋白单克隆抗体的筛选及初步鉴定

目的制备人源抗脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体,并对该抗体的效价进行初步鉴定。方法以人脂多糖结合蛋白(human lipopolysaccharide binding protein,hLBP)为抗原,以人源噬菌体抗体库进行筛选,经5轮“吸附洗脱扩增”的富集反应后,筛选出3株抗人LBP阳性克隆株,抽提其质粒、切除geneⅢ、自身环化并电转入XL1blue后,以IPTG诱导分泌表达可溶性抗体,通过ELISA法测定抗体效价。结果抗体库被浓缩8.16×104倍,获得3个与LBP结合能力较强的单克隆菌株,其中结合力最强者产生抗体活性为106。结论成功获得针对人LBP的Fab抗体,经初步鉴定具有较高效价,为下一步研究该抗体功能奠定基础。     

LPS/CD14结合位点模拟肽对内毒素性大鼠急性肺损伤的治疗作用

目的 观测LPS/CD14结合位点模拟肽(mimic peptides 12,MP12)对内毒素性急性肺损伤大鼠模型的治疗作用.方法 将30只Wistar大鼠按随机数字表法分为生理盐水对照组、LPS组和LPS+ MP12组(n=10).另将40只Wistar大鼠分为两组,分别接受与LPS组和LPS+ MP12组相同的处理方法,用于观测死亡率.采用LPS静脉注射法复制内毒素性急性肺损伤大鼠模型.LPS+ MP12组在接受LPS注射后立即予MP12静脉注射.2h后抽取静脉血用于检测血浆内毒素浓度.于12 h抽取动脉血,检测动脉血氧分压(PaO2).24h后处死各组大鼠,留取右下肺用于病理检查,右上肺匀浆检测TNF-α,留取左肺行支气管肺泡灌洗并分离肺泡巨噬细胞.采用荧光显微镜检测MP12对肺泡巨噬细胞与LPS结合的抑制作用.结果 LPS组及LPS+ MP12组的血浆内毒素浓度明显高于生理盐水对照组(P＜0.01),而LPS组与LPS+ MP12组间血浆内毒素浓度无显著差异(P＞0.05).LPS组及LPS+ MP12组PaO2显著低于生理盐水对照组(P＜0.01),但LPS+ MP12组PaO2显著高于LPS组(P＜0.01).LPS+ MP12组肺组织TNF-α浓度及病理学评分显著低于LPS组(P＜0.01).LPS+ MP12组肺泡巨噬细胞与LPS的结合率显著低于LPS组(P＜0.01).LPS+ MP12组的72 h死亡率显著低于LPS组(40％ vs 75％,P＜0.01).结论 LPS/CD14结合位点模拟肽(MP12)能通过阻断内毒素与肺泡巨噬细胞的结合,减轻内毒素导致的肺部炎症及病理损害,显著提高内毒素性急性肺损伤大鼠的动脉血氧分压、减少死亡率.     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

噬菌体展示短肽模拟脂多糖结合蛋白抗炎功能位点的研究

目的应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaceharide binding protein,LBP)具有抗炎作用的肽序列.方法以LPS为目标分子,对噬菌体十二肽库进行亲合筛选,4轮筛选后,检测随机挑取的噬菌体克隆的结合活性和抑制活性,对可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆行细胞因子生成抑制实验和LPS内化抑制实验,对获得的阳性克隆进行DNA序列测定,推导外源肽氨基酸序列,并与LBP序列比较,确定LBP的抗炎功能位点.结果随机挑取的100个噬菌体克隆中16个可与LBP竞争性结合LPS,其中7个噬菌体克隆对LBP的增敏LPS刺激PBMC分泌TNF-α功能无作用,对这7个克隆进行LPS内化抑制实验,其中3个克隆可以抑制LBP增强LPS内化作用.测序发现这3个阳性克隆融合多肽的序列均为FHTRWNYWPYLH,与IBP一级结构氨基酸序列同源性低.结论该12肽序列可以模拟LBP的抗炎功能位点.     

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

从噬菌体肽库中筛选生长因子模拟肽的研究进展

生长因子通过膜受体可将胞外信号转导至胞内,现已发现一些小分子肽能够作为受体的配体模拟天然配体的生物学作用.以可溶性受体的纯化蛋白或转染了膜受体的完整细胞为靶标,人们从噬茵体肽库中筛选出多种模拟肽,对这些肽的序列和生物学功能进行分析,发现它们能够竞争受体与天然配体相结合,可作为生长因子受体的拮抗剂或激动剂.噬菌体展示技术的应用不仅为生物大分子间的结构和功能关系提供信息,而且为新药的研究提供了新思路.本文对从噬菌体肽库中筛选生长因子受体肽类拮抗剂或激动剂的研究进展作一综述.     

抗大肠杆菌LPS多克隆抗体的制备与LPS模拟肽的筛选

目的获得抗大肠杆菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS表位的线性噬菌体展示肽克隆。方法制备兔抗鼠大肠杆菌抗血清,鉴定抗血清效价。以亲和纯化的多克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机线性十二肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与大肠杆菌LPS反应。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行三轮筛选,随机挑选17个克隆,其中6个克隆显示与多抗结合。大肠杆菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为250ng/ml。结论获得能与大肠杆菌LPS反应兔多克隆抗体,筛选得到可模拟大肠杆菌LPS表位的噬菌体展示线性十二肽。     

急性胆道感染时肝组织脂多糖受体CD14的表达机制

目的 探讨急性胆道感染时大鼠肝组织巾脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)受体CDl4的表达及其对细胞因子分泌的影响.方法 通过结扎Wiser大鼠月日总管,在胆总管内注人大肠杆菌0111:B4,复制急性胆道感染动物模型.于术后0、3、6、12、24 h分别检测肝组织中CDl4蛋白和mRNA表达水平,血浆内毒素、TNF-Ot和IL-6的含量、枯否细胞(kupffer cells,KCs)吞噬活性,电镜观察KCs超微结构的变化.结果 在急性胆道感染时随着感染时间延长,血浆内毒素浓度逐渐升高,KCs呈现激活的改变,血浆TNF-a、IL-6含量明显增加,而此时肝组织中CD14的表达也显著增加.结论 急性胆道感染时肝组织中CD14的表达进行性增强,KCs激活,释放的细胞因子也逐渐增多,这可能是急性胆道感染时KCs敛炎作用增强的重要机制之一.     

急性肺损伤大鼠肺组织TOLL样受体4及CD14mRNA的表达

目的 探讨内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织TOLL样受体4及CD14 mRNA表达的变化.方法 24只雄性Wistar大鼠随机分为2组:对照组、LPS模型组,每组再分为4 h和8 h两个亚组.尾静脉注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立大鼠急性肺损伤模型.检测大鼠动脉血气、肺体指数,实时荧光定量PCR测定肺组织TOLL样受体4及CD14 mRNA的表达,并观察肺组织病理变化.结果 与对照组相比,模型组4 h和8 h时大鼠肺组织中的TLR4及CD14 mRNA表达均显著增高(P＜0.05或P＜0.01).病理学观察显示,模型组大鼠肺组织出现出血及坏死.结论 内毒素致急性肺损伤的发病机制可能与TLR4及CD14 mRNA的表达升高有关.     

CD14的B细胞抗原表位预测

目的预测人CD14抗原的B细胞表位。方法采用生物信息软件和互联网服务器，预测CD14的二级结构，分析CD14表面特性（亲水性、可塑性、可及性和抗原性），再计算平均抗原指数（AI）预测CD14的B细胞抗原表位。结果CD14存在多个潜在的抗原表位，257-271序列（shnslratvnpsapr）的AI（0.04413）明显高于其它序列，305-321序列（sc-nrlnrapqpdelpev）、19-34序列（ttpepcelddedfrc）和115-134序列（ysrlkeltledlkitgtmpp）的AI分别是0.03682、0.03256和0.03025。结论257-271序列（shnslratvnpsapr）是CD14的B细胞优势抗原表位，可用于制备CD14的特异性抗体。     

酒精性肝病大鼠Kupffer细胞CD14蛋白的表达及其在肝损害中的作用

目的:观察大鼠酒精性肝病时细胞()蛋白和基因的表达及其在肝损害中的作用。KupfferKCsCD14方法:随机将大鼠分为乙醇喂养组(剂量～)和葡萄糖对照组。周和周活杀分离,用流式细胞仪()测定细Wistar 512g/kg/24h48KCsFCM胞膜上蛋白的表达,同时用逆转录多聚酶联反应()测定中的表达;用酶联免疫法()CD14RT-PCRKCsCD14 mRNAELISA测定血浆中TNF-α和-浓度变化;测定血浆内毒素及血浆中转氨酶()水平变化,并观察肝脏形态学改变。IL6ALT结果: 乙醇组大鼠周时膜上已明显表达蛋白和　,周时其表达进一步增强,显著高于对照组4KCsCD14CD14mRNA8(P。乙醇<0.05)组周和周时血浆48TNF-α浓度、-浓度及内毒素浓度均明显高于对照组IL6 (P。乙醇组肝组织发生显著的病理变化,对<0.05)照组肝组织无明显病理变化。结论:乙醇能诱导大鼠肝脏膜蛋白和的表达显著增强,血浆中细胞因子KCsCD14CD14 mRNA-TNFα和-浓度增加,引起肝脏形态改变和功能损害。IL6     

严重烧伤对小鼠CD14 mRNA表达的影响

单核、巨噬细胞(Mψ)被激活产生肿瘤坏死因子(TNF)等重要炎性介质的最基本途径是脂多糖(LPS)/脂多糖结合蛋白(LBP)复合物与单核细胞、Mψ表面的CD14结合,继而引发细胞内一系列反应[1].     

重庆地区汉族CD14启动子区多态性分析

目的调查CD14(-260)多态性在重庆地区汉族中的分布特征,及检验该随机样本遗传学研究的可靠性.方法对110名重庆汉族个体,采用降落式PCR和限制性片段长度多态性法(RFLP)进行基因型分析.结果重庆地区汉族CD14(-260)多态性TT、TC、CC 3种基因型频率分别为43.6%、39.1%和17.3%; 样本分布符合Hardy-Weinberg平衡.结论重庆汉族CD14(-260)多态性基因型分布特征与白种人存在明显差异.样本为H-W平衡群体,可进一步用于重庆汉族全身性炎症反应的关联分析.     

脂多糖结合蛋白抑制肽对内毒素诱导的人单核巨噬细胞株表达CD14的影响

目的研究脂多糖结合蛋白(LBP)抑制肽对内毒素(LPS)诱导的人单核巨噬细胞株U937细胞表达CD14的影响。方法佛波脂(PMA)诱导U937成熟后分为5组:正常对照组、LPS组(100ng/mLLPS 100ng/mLrhLBP)、低剂量抑制肽组、中剂量抑制肽组及高剂量抑制肽组,后3组分别给予10、100和1000ng/mL抑制肽。用RTPCR和蛋白定量方法(Westernblot)测定CD14mRNA和蛋白的表达,ELISA测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量。结果LBP抑制肽显著抑制LPS刺激后U937细胞CD14的mRNA与蛋白表达,同时也抑制了TNFα的分泌,较LPS组有显著差异。结论LBP抑制肽通过抑制由CD14介导的LPS信号跨膜转导和TNFα的分泌,对LPS所致疾病如脓毒血症、急性肺损伤可能有潜在的治疗作用。     

Cholecystokinin octapeptide inhibits the in vitro expression of CD14 in rat pulmonary interstitial macrophages induced by lipopolysaccharide

Obejective To study the effect of cholecystokinin octapeptide (CCK-8) on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated pulmonary interstitial macrophages （PIM） in vitroMethods PIM were isolated and cultured in the presence or absence of LPS, CCK-8, proglumide (the antagonist of CCK receptors) and vehicle. The expression of membrane CD14 (mCD14) protein was assayed by flow cytometry and soluble CD14 (sCD14) in the supernatant was analyzed semi-quantitatively by Western blot. TNF-α in the supernatant was detected with ELISA.Results CCK-8, at concentrations of 10［-7］ mol/L and 10［-6］ mol/L, significantly inhibited the expression of mCD14. Release of sCD14 and TNF-α in the supernatant was up-regulated by LPS (1μg/ml) but reduced by CCK-8. The effect of CCK-8 was inhibited by proglumide.Conclusion CCK-8 negatively modulated several functions of LPS-stimulated PIM through CCK receptors. This may be one of the mechanisms for CCK-8 to alleviate inflammation in lung tissue during endotoxemia.