猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导兔脂肪基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

[目的]分离培养兔脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),观察在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导下其生物学特性及向软骨细胞定向分化的能力.[方法]取4个月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织,分离、培养ADSCs.选取第3代,分为两组,实验组用软骨诱导液(含TGF-β1、bFGF、IGF)对细胞进行培养,对照组用普通高糖培养液培养,倒置显微镜观察两组细胞形态,MTT测定其增殖情况;14 d后行组织学观察(包括甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化),并实时荧光定量PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9基因的表达情况.[结果]实验组细胞逐渐变为软骨样细胞形态,增殖速度明显加快,14 d后实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,对照组为阴性,荧光定量PCR结果显示实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9的基因转录水平明显高于对照组.[结论]在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导条件下ADSCs增殖迅速,可高表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9,向软骨细胞定向分化.     

滚压载荷生物反应器促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

[目的]观察滚压载荷生物反应器对BMSCs-琼脂糖复合体中BMSCs向软骨细胞诱导分化的作用。[方法]分离新西兰兔BMSCs,培养至第3代后与低熔点琼脂糖复合成凝胶块并在自制的模具中形成直径为4 mm、高4 mm的圆柱形胶块。将样本分为TGF-β1+力学组、TGF-β1组、力学组和对照组。在第7、14、21 d时去各组标本进行实时定量PCR、GAG含量检测以及组织学染色。[结果]TGF-β1+力学组II型胶原基因表达在第7、14、21 d 3个时间点随时间的推移逐渐增强,并在第21 d时显著增强。TGF-β1+力学组蛋白聚糖基因在第21 d时也较对照组显著增强并且高于其他两组。对照组的II型胶原和蛋白聚糖基因在3个时间点均见明显增强。TGF-β1+力学组GAG含量在3个时间点均明显升高(P<0.05)并且均高于其余三组。TGF-β1+力学组标本甲苯胺蓝染色较其余各组明显蓝染,并有软骨陷窝样结构。[结论]滚压载荷生物反应器可以有效促进BMSCs-琼脂糖复合体中BMSCs向软骨细胞诱导分化。在结合TGF-β1后这种促进作用更加明显。     

非接触共培养条件下山羊BMSCs向纤维环样细胞诱导分化的研究

[目的]建立山羊骨髓源性间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和纤维环细胞(annulus fibrosus cells,AFCs)非接触共培养体系,探讨BMSCs向纤维环样细胞诱导分化潜能,为组织工程修复纤维环缺损研究提供种子细胞。[方法]复苏第3代AFCs和BMSCs,观察细胞形态并绘制生长曲线。采用Transwell系统共培养AFCs和BMSCs,7 d后,检测BMSCs向纤维环样细胞分化情况。通过甲苯胺蓝染色检测聚集蛋白聚糖的表达,通过免疫细胞化学法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达,realtime PCR检测Ⅰ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox-9 mRNA表达。[结果]非接触共培养7 d后,BMSCs形态转变为纤维环细胞样。非接触共培养组中BMSCs的聚集蛋白聚糖与Ⅰ型胶原染色呈阳性,与AFCs对照组结果一致,BMSCs对照组结果呈阴性。与AFCs对照组相比,共培养组中Ⅰ型胶原、聚集蛋白聚糖及Sox-9的mRNA表达量分别为0.86、1.13和0.91(P>0.05),而BMSCs对照组中未检测到其表达。[结论]建立稳定的山羊AFCs和BMSCs非接触共培养体系,共培养7 d后,BMSCs具有AFCs特性,表明共培养条件促进BMSCs诱导分化为纤维环样细胞。     

转化生长因子-β1诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞转化的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的可能性.方法 密度梯度法分离培养兔BMSCs,取BMSCs(P3).实验组:含TGF-β1的诱导培养基,对照组:不含TGF-β1诱导培养基,体外培养两周.阿尔新蓝法(Alcian blue)检测培养基内葡糖胺聚糖(GAG)含量.培养第14天,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测髓核样细胞Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)及聚集蛋白多糖(Aggrecan) mRNA基因表达.免疫组织化学法测定CollagenⅡ的含量变化.结果 GAG检测结果显示,第7、10、13天实验组GAG含量均显著高于对照组(P＜0.01).实验组CollagenⅡ免疫组织化学染色阳性,表达量较对照组高.Real-time PCR结果证实:实验组CollagenⅡ和Aggrecan mRNA表达水平较对照组显著增高(P＜0.01).结论 TGF-β1能明显增加BMSCs向髓核样细胞分化的诱导生物活性,促进BMSCs向髓核样细胞定向分化.     

TGF—β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞(ADSCs),观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分:Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage,ColⅡ)和aggrecan的合成,为构建新型的组织工程软骨提供实验依据.[方法]TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选;RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FiN)、ColⅡ、Aggrecan的表达;Western-blot检测TGF-β1.[结果]RT-PCR结果显示:实验组(TGF-β1稳定转染组)的TGF-β1、FN、Col Ⅱ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01);Western blot检测实验组(TGF-β1稳定转染组)TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01).[结论]成功分离培养脂肪干细胞;以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多,表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化,从而为软骨组织工程提供新的思路和方法.     

TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的研究

【摘要】 目的：探讨利用转基因技术构建的转化生长因子β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）和骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP-7）重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs）,诱导其向类髓核细胞分化的可行性。方法：将培养获得的BMSCs分成5组,A：空白对照组,B：免疫荧光对照组,C：TGF-β3单独转染组,D：BMP-7单独转染组,E：TGF-β3+BMP-7共转染组。利用转基因技术构建的TGF-β3和BMP-7重组腺病毒对BMSCs进行转染,荧光显微镜观察其转染效率,培养14d后,再以Western-Blot方法检测A、C、D、E组细胞TGF-β3和BMP-7蛋白分泌情况,以Realtime PCR方法检测各组蛋白聚糖（ACAN）、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、Ⅹ型胶原（Collagen Ⅹ）、SOX9基因表达水平,明确腺病毒转染后兔骨髓间充质干细胞的分化情况。结果：以TGF-β3和BMP-7重组腺病毒转染兔BMSCs后常规DMEM培养基培养14d,细胞形态出现明显变化,圆形及椭圆形细胞明显增多。Western blot方法检测,共转染组TGF-β3和BMP-7蛋白表达水平明显增高。培养14d时,Realtime PCR检测ACAN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、SOX9基因的表达水平转染组（C、D、E组）较对照组（A、B组）明显升高（P<0.05）,其中Collagen Ⅰ和SOX9表达单独转染组（C、D组）与共转染组（E组）比较差异无显著性（P>0.05）,Collagen Ⅱ表达共转染组较单独转染组明显增高（P<0.05）。TGF-β3单独转染组和共转染组的Collagen Ⅹ基因表达较BMP-7单独转染组和对照组明显降低（P<0.05）。结论：转基因技术重组TGF-β3和BMP-7腺病毒可成功转染兔BMSCs,获得TGF-β3和BMP-7蛋白的表达。TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔BMSCs后,可有效诱导兔BMSCs向类髓核细胞方向分化。     

细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的 体外诱导犬骨髓基质干细胞(BMSCs)定向分化为软骨细胞，探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法 自犬肋骨取骨髓2～3ml，体外行原代和传代培养扩增，顺序加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)，以培养瓶内较高细胞浓度培养，诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果 诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性；Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论 应用bFGF和TGF-β1体外可以诱导犬BMSCs分化为软骨细胞，诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

不同强度张应力刺激影响关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的研究

目的观察不同强度张应力刺激对人体体外培养的关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的影响。方法获取因股骨颈骨折行髋关节置换术患者的股骨头关节软骨细胞。对第一代关节软骨细胞分别施加强度为3%、6%、15%延伸率的张应力刺激,张应力刺激后提取细胞的总RNA,进一步逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达。结果虽然3%和6%的张应力刺激均可增加Ⅱ型胶原mRNA的表达,但没有统计学意义;15%的张应力刺激能明显抑制Ⅱ型胶原mRNA的表达,且有统计学意义。尽管张应力刺激均可增加聚集蛋白聚糖mRNA的表达,但均没有统计学意义(P0.05)。结论不同强度的张应力刺激对关节软骨细胞表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的影响不同。15%延伸率的张应力刺激可明显抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原基因的表达,但不能明显改变聚集蛋白聚糖基因的表达,这可能与关节软骨细胞的功能适应性有关。