乳鼠及人肺原代成纤维细胞的分离培养

目的 建立体外原代培养乳鼠及人肺成纤维细胞的方法.方法　采用非胰酶消化组织块法培养乳鼠及人肺成纤维细胞,细胞长出组织块后经形态学检测确定是否为成纤维细胞.结果 乳鼠肺成纤维细胞需3～5 d可增殖形成单层,并进行第1次传代;人肺成纤维细胞30～35 d左右增殖形成单层,并进行第1 次传代.结论 非胰酶消化组织块法是一种可行的成纤维细胞培养方法.     

风湿性心脏病患者心房成纤维细胞的原代培养

目的建立一种人心房成纤维细胞原代培养简单有效的方法。方法新鲜右心耳组织取自心外科风湿性心脏病手术患者,采用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化法分离细胞,用含2O%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代,显微镜下观察心房成纤维细胞生长状况。波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅷ因子(VWF)抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。结果获取大量细胞,形态典型;Vimentin、α-SMA表达阳性,VWF阴性,鉴定为心房肌成纤维细胞。结论胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化法是一种简单有效的人心房成纤维细胞原代培养方法。     

新生树鼩心肌细胞与心肌成纤维细胞的分离培养、纯化及鉴定

摘要:目的 为了分离得到可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞。方法 使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最适纯化方案,培养过程在37℃、5%CO2条件下进行。使用MTT法测定细胞活力以确定方法可行性。利用α-横纹肌肌钙蛋白（α-SA）及心肌肌钙蛋白I（Tn I）对树鼩心肌细胞进行免疫组化及免疫荧光鉴定,利用波性蛋白（Vimentin）对树鼩心肌成纤维细胞进行免疫荧光染色以达到鉴定目的。结果 原代培养新生树鼩心肌细胞生长良好。在倒置显微镜下观察,培养10d左右的心肌细胞可以基本完成局部融合并有伴细胞搏动。MTT法检测结果显示心肌细胞活力可以在最少15d内保持良好水平。细胞鉴定结果显示树鼩心肌细胞α-SA免疫组化呈阳性,Tn I免疫荧光鉴定呈阳性,心肌成纤维细胞呈阴性,符合一般心肌细胞特征;心肌成纤维Vimentin免疫荧光结果呈阳性。结论 分离纯化得到的树鼩心肌细胞和心肌成纤维细胞,细胞纯度较高、结构完整并具有相对较高的细胞活力,是一种较为理想的、可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的心肌细胞和心肌成纤维细胞。     

人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定

目的对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定,探讨一种高效的分离及纯化方法,为细胞移植提供种子细胞。方法使用酶消化法原代提取人成纤维细胞,快速贴壁法纯化细胞,对细胞进行形态学观察、HE染色,免疫细胞化学鉴定细胞标志物Vimentin。结果利用倒置显微镜及HE染色,可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞,当细胞汇流时,呈鱼群样或漩涡状排列,且细胞在15代内形态保持不变。结论成功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法,为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。     

人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定

立体外稳定培养hFbs的方法,为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础.     

胰岛β细胞的分离纯化与原代培养技术

胰岛β细胞是糖尿病研究的中心环节之一。目前体外研究胰岛β细胞的模型系统有两类，一是从胰岛β细胞瘤组织克隆产生的β细胞株，二是从活体胰岛组织分离纯化获取胰岛β细胞。国内利用细胞株作为研究模型者较多，而β细胞的体外原代培养尚未见研究报道。     

成纤维细胞生长因子与肺疾病

成纤维细胞生长因子(FGF)是一种多功能的多肽生长因子家族。具有很强的促细胞生长及促血管生成活性,本文着重阐述了FGF的生化,生理特性及其在多种肺疾病中的作用。     

大鼠肺动脉和主动脉成纤维细胞的原代培养及生物学行为研究

目的 建立大鼠肺动脉和主动脉外膜成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的方法,并对其细胞形态和成纤维细胞转化成肌成纤维细胞的特征进行观察.方法 通过精分肺动脉和主动脉,剥取外膜,用10％的胎牛血清低糖DMEM培养基诱导细胞爬出生长.倒置显微镜下观察成纤维细胞形态,并对细胞进行免疫荧光鉴定.通过对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的观察确定传代细胞是否转化为肌成纤维细胞.结果 成纤维细胞能够迅速从剥取的外膜中爬出生长,波形蛋白细胞免疫荧光染色为阳性.主动脉成纤维细胞和肺动脉成纤维细胞形态差别大,前者为铺路石状,后者呈细长梭形.2种成纤维细胞经传代皆能转化为肌成纤维细胞,免疫荧光染色可见α-SMA大量表达,前者包围着细胞核呈条索状非定向分布,后者平行于细胞长轴呈细丝状表达.结论 该方法所获得的成纤维细胞纯度高,可在体外稳定培养.本研究首次发现了肺动脉和主动脉成纤维细胞形态学及生物行为上的差别,为细胞水平研究主动脉和肺动脉血管重塑,胶原沉积等相同或不同的病理机制提供了充足可靠的靶细胞模型.     

东方田鼠肺成纤维细胞的分离培养及其对日本血吸虫的杀伤作用

目的探索和建立东方田鼠肺成纤维细胞体外分离、培养的技术方法,并观察其对日本血吸虫的杀伤作用。方法运用含15%小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液(DMEM)和RPMI 1640两种培养体系,采用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1、3和5 d的东方田鼠乳鼠肺成纤维细胞(Microtus fortis lung fibroblasts,MfLF)进行原代分离、培养,倒置显微镜下观察MfLF形态和生长特性.第2代和第3代MfLF培养上清与日本血吸虫童虫共培养96 h,观察其对童虫的杀伤效果。结果实验发现,采用胰酶消化法培养,只有少量MfLF细胞缓慢贴壁生长,而组织块贴壁法MfLF贴壁速度较快。不同日龄幼鼠的肺成纤维细胞采用组织块贴壁法培养,细胞活率和细胞纯度以1～3日龄乳鼠为最佳。在DMEM和RPMI 1640两种培养液中MfLF均可传代培养,两者无明显差异。MfLF体外只可传代4～5次。日本血吸虫童虫经第2代和第3代MfLF培养上清处理后,死亡率分别为9.5%和10.5%,与阴性对照(8.8%)比较差异无统计学意义(P<0.05)。结论提示组织块贴壁法适用于MfLF的体外培养,但MfLF培养上清对日本血吸虫童虫无明显杀伤效果。     

大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法的研究

目的探讨肺微血管内皮细胞(PMVECs)的分离培养方法。方法应用复合酶消化法获取Sprague Dawley大鼠的PMVECs,经传代培养纯化,并通过观察光镜下细胞的形态学特征、免疫细胞化学染色检测细胞内Ⅷ因子抗原的存在、透射电镜观察细胞超微结构等进行综合鉴定。结果体外培养的原代PMVECs在光镜下呈典型的铺路石样排列...     

新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良

目的改良简化心肌细胞培养的条件和方法,培养纯度高、存活时间长的新生SD大鼠的心肌细胞。方法采用含牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）的Ⅱ型胶原酶单次消化心肌、差速贴壁1 h纯化心肌细胞进行培养,全过程在37℃条件下进行。于培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,并在生物倒置显微镜下观察形态学变化。取培养48 h的细胞,用免疫组织化学染色的方法检测心肌细胞的纯度。结果心肌组织在6 h时基本消化完全。培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测心肌细胞的存活率均大于95%,培养30 d时仍为95.2%。在生物倒置显微镜下观察,培养24 h左右的细胞之间形成交联并有细胞搏动。培养48h的细胞经免疫组织化学染色法测定,心肌细胞的纯度为（97.1±1.9）%。结论应用改良并简化的心肌细胞培养方法和培养条件,可得到纯度和存活率均高能满足大多数科研要求的原代乳鼠心肌细胞。     

Simplified isolation and spheroidal aggregate culture of rat hepatocytes

ＳｉｍｐｌｉｆｉｅｄｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｐｈｅｒｏｉｄａｌａｇｇｒｅｇａｔｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓＷＡＮＧＹｉｎｇＪｉｅ,ＬＩＭｅｎｇＤｏｎｇ,ＷＡＮＧＹｕＭｉｎ,ＤＩＮＧＪｉａｎ,ａｎｄＮＩＥＱｉｎｇＨｅＳｕ...     

人胚胎窦房结细胞原代培养及纯化方法探讨

目的:探讨人胚胎窦房结细胞的原代培养及纯化方法,寻找一种较为可行的适宜于人胚胎窦房结细胞生长的方法。方法:取人工水囊引产的12～16周人胚胎心脏,随机分为实验组及对照组,取其窦房结组织分别进行细胞培养,观察和比较两个培养组中各种细胞的数量及生长状况,以细胞的搏动频率评价细胞的活性,以梭形细胞的数量评价窦房结细胞的纯度。结果:实验组简化了操作环节,优化了细胞的培养环境,可提高细胞的活性;经过差速贴壁阿糖胞苷纯化处理,可明显减少不规则细胞的数量,窦房结细胞的数量明显上升(P<0.05)。结论:纯化培养法是一种较为可行的人胚胎窦房结细胞原代培养方法,可为进一步研究提供生长较稳定的窦房结细胞。     

成年大鼠成肌细胞的原代培养

目的　探索成年大鼠成肌细胞的原代培养方法。方法　取成年SD大鼠的胸大肌 ,利用组织块培养法培养成肌细胞。绘制生长曲线 ,并对培养细胞进行形态学研究和免疫细胞化学鉴定。结果　采用组织块培养法 ,2周后成肌细胞的密度可达 10 7/ml,免疫细胞化学分析显示 90 %以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞生成素 (myogenin)抗体染色阳性。结论　利用组织块法成功培养成年大鼠原代成肌细胞 ,该方法实用性强 ,所得成肌细胞纯度高 ,为深入研究心肌梗死疤痕中成肌细胞自体移植奠定了基础。     

Acyl CoA synthetase from rat lung purification and properties

Long chain fatty acyl-CoA synthetase, a key enzyme in fatty acid metabolism, occurs in liver, brain, muscle, adipose tissue and bacteria. In our study, rat lung was found to have an acyl-CoA synthetase very active for the synthesis of palmitoyl CoA. The lung microsomal and cell membrane fractions were the principle sources of this enzyme, with mitochondria the next most active fraction. Palmitoyl CoA synthetase was isolated from rat lung microsomes and purified 100-fold. Enzyme activity was determined either by spectrophotometric or by radioactive assay methods. Kinetic parameters and properties were determined using purified microsomal palmitoyl CoA synthetase. The assay system required ATP and CoA as substrates. Maximal activation was reached with palmitate as substrate.     

辛伐他汀对大鼠肺成纤维细胞的影响观察

目的 :探讨辛伐他汀 (Sim)对大鼠肺纤维化阶段肺成纤维细胞 (LFb)增殖和胶原合成的影响及其机制。方法 :肺纤维化 1周组肺泡巨噬细胞 (AM)条件培养上清液与正常大鼠LFb共同培养 ,并给予不同浓度的Sim干预 ,利用3H 胸腺嘧啶核苷掺入法、3H 脯氨酸掺入法和Western杂交测定LFb增殖、胶原合成和Ras蛋白的翻译后修饰。结果 :Sim浓度依赖性的抑制肺纤维化 1周组AM条件培养上清液促LFb的增殖和胶原合成作用 (Sim 5 μM、10 μM、5 0 μM时 ,P <0 0 5 ) ,并抑制Ras蛋白加工。 结论 :辛伐他汀可以抑制肺纤维化阶段LFb增殖 ,减少胶原合成 ,可能通过影响Ras蛋白的加工起作用     

SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞组织贴块法培养及鉴定

目的建立SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)组织贴块培养法并进行鉴定。方法无菌条件下取大鼠胸主动脉,4⁶h后加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,原代培养2周并用免疫荧光染色对培养的VSMC进行鉴定。结果组织贴块法成功培养了大鼠胸主动脉VSMC,56h后加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,原代培养2周并用免疫荧光染色对培养的VSMC进行鉴定。结果组织贴块法成功培养了大鼠胸主动脉VSMC,5⁷d细胞迁出,107d细胞迁出,10¹4d细胞融合至80%进行传代。体外培养的VSMC可传至20代,培养的细胞呈典型的"峰谷"样生长,免疫荧光染色鉴定细胞纯度达95%。结论组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMC培养体系稳定,操作简单、方便,纯度较高,免疫荧光是鉴定VSMC的较佳方法。     

Comitogenic effect of catecholamines on rat cardiac fibroblasts in culture

OBJECTIVE: We studied the ability of norepinephrine and of other catecholamines to affect the proliferation of cardiac fibroblasts isolated from adult rat hearts. Furthermore, we investigated the possible adrenergic receptor involved in this process. METHODS: Norepinephrine (NE), phenylephrine (PE), isoproterenol (ISO), forskolin (FO), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor AA (PDGF-AA) and specific inhibitors of the alpha(1)-, alpha(2)-, beta(1)- and beta(2)-adrenoceptors and of the protein kinase A (PKA) were applied to cardiac fibroblasts in culture. Cell number was measured by use of a Coulter Counter. Activation of the cAMP response element binding protein (CREB) was measured by Western blotting and subsequent use of a phospho-specific antibody. Activation of the p42- and the p44-mitogen activated protein kinase (p42/p44(MAPK)) was assessed by detection of phosphorylation shifts and by incorporation of 32P-labelled phosphate into myelin basic protein. RESULTS: Fibroblasts isolated from hearts of adult rats were grown in 10% serum-containing media which induced an increase in cell number by 94%. After 48 h, treatment with 10 microM NE caused an even greater increase in cell number by 222%, i.e. another 128% (comitogenic effect). In contrast, NE alone had no effect on the growth of serum-deprived cells. EGF and PDGF-AA did not replace serum as the basic mitogen. After addition of NE to proliferating cells under serum conditions, there was a rapid, time-dependent significant activation of the p42/p44(MAPK) and of CREB for up to 60 and 120 min, respectively. In both cases, the maximum of activation was reached after 5 min. Application of FO (0.1-20 microM) caused a strong activation of CREB, while no increase in the phosphorylation of the p42/p44(MAPK) was detected. Treatment with 20 microM FO led to an identical increase in cell number as application of NE. Specific blockade of PKA with RpcAMPS prevented the activation of CREB and also the comitogenic effect of FO as well as of NE. The alpha- and beta-adrenergic receptor blocker carvedilol (10 microM) normalized all NE-induced effects. Prazosin and yohimbine, inhibitors of alpha(1)- and alpha(2)-adrenoceptor activation, respectively, did not influence the NE-evoked increase in cell number. In contrast, the non-selective beta-adrenoceptor blocker propranolol (1 microM) completely suppressed the comitogenic effect of NE. A similar effect was obtained with the specific beta(2)-adrenoceptor blocker ICI 118,551 (5 microM), while the beta(1)-adrenoceptor blocker metoprolol did not influence the increase in cell number. CONCLUSIONS: NE elicits a comitogenic effect on cultured rat cardiac fibroblasts which is prevented by beta(2)-adrenergic blockade. The activation of CREB contributes to the increase in proliferation. The p42/p44(MAPK) which was also found to be activated by NE might as well be involved in the regulation of the comitogenic effect.