紫檀芪对中波紫外线照射的HaCaT细胞抗氧化物酶表达及活性的影响

目的 探讨紫檀芪对HaCaT细胞急性中波紫外线（UVB）损伤的防御作用及相关机制。方法 MTS法和流式细胞仪检测不同浓度紫檀芪作用后HaCaT细胞增殖活性及凋亡与坏死率,筛选无毒性紫檀芪浓度。HaCaT细胞随机分为对照组（不做任何处理）、UVB组和2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪组及2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪 + UVB组。Western印迹法检测紫檀芪和UVB处理前后HaCaT细胞内Nrf2核转位情况,定量PCR检测过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的表达,ELISA检测CAT和SOD活性。结果 MTS法和流式细胞仪检测结果显示,2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪对HaCaT细胞无毒性作用。对照组Nrf2胞质蛋白1.03 ± 0.08、胞核蛋白1.04 ± 0.11;与对照组比较,2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪组Nrf2胞质蛋白和胞核蛋白均无明显变化,UVB组Nrf2胞质蛋白无明显变化,但Nrf2胞核蛋白显著增加（1.77 ± 0.08,q = 17.24,P < 0.01）。与对照组及UVB组比较,2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪 + UVB组Nrf2胞质蛋白浓度均显著下降（0.86 ± 0.10、0.87 ± 0.11、0.46 ± 0.11,均P < 0.05）,胞核蛋白浓度则显著升高（2.38 ± 0.11、2.57 ± 0.11、2.07 ± 0.13,均P < 0.01）。qPCR显示,与对照组相比,UVB照射对CAT mRNA表达有明显的抑制作用（P < 0.05）,对SOD mRNA表达则无明显影响（P > 0.05）,2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪组CAT和SOD的表达亦均无明显变化（P > 0.05）。然而,2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪可减轻UVB对CAT表达的抑制（P < 0.05）,并上调SOD的表达（P < 0.05）。ELISA显示,UVB照射可显著降低HaCaT细胞内CAT和SOD活性（均P < 0.001）,2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪可减轻UVB对CAT和SOD活性的抑制作用（P < 0.05）,但其活性仍明显低于对照组（P < 0.05）。结论 紫檀芪可通过激活Nrf2通路,上调其下游抗氧化物酶CAT、SOD表达,防御HaCaT细胞急性UVB损伤。     

姜黄素对紫外线照射后HaCaT细胞内Nrf2核转位的激活作用

目的:明确姜黄素对急性紫外线损伤的HaCaT细胞内Nrf2核转位的影响。方法:1μM、2.5μM、5μM姜黄素与细胞共培养,UVA、UVB照射后Western blot法检测各实验组HaCaT细胞内Nrf2核转位情况。结果:姜黄素预处理后照射UVA和UVB,Nrf2胞质蛋白的浓度随姜黄素的浓度升高而下降,胞核蛋白浓度则随其升高而升高(P0.05)。结论:姜黄素对急性紫外线损伤的HaCaT细胞内Nrf2核转位有激活作用。     

紫外线对HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1的影响

目的 探讨HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1)的光控作用及其机制.方法 培养的HaCaT细胞分为225 mJ/cm2 UVA刺激组和25 mJ/cm2UVB刺激组,UVA刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组(UVA-TRPA1对照组)、视黄醛+UVA+肉桂醛组(UVA-TRPA1激动组)、视黄醛+UVA+樟脑组(UVA-TRPA1抑制组);UVB刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组(UVB-TRPA1对照组)、视黄醛+ UVB+肉桂醛组(UVB-TRPA1激动组)、视黄醛+UVB+樟脑组(UVB-TRPA1抑制组).qPCR、Western印迹检测HaCaT细胞中TRPA1的表达.流式细胞仪检测各组HaCaT细胞钙离子内流的变化.结果 qPCR和Western印迹显示,HaCaT细胞中有TRPA1 mRNA及蛋白的表达.UVA作用后空白对照组、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组荧光强度分别为155.06±7.62、148.37±18.77、166.92±3.71、331.333±40.563,组间差异有统计学意义(F=44.509,P＜0.01).UVB作用后空白对照组、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组荧光强度分别为150.20±1.73、171.66±56.23、147.56±6.60、250.44±9.13,组间差异有统计学意义(F=85.261,P＜ 0.01),视黄醛+UVA/UVB组荧光强度均高于空白对照组(q值分别为18.442、6.052,P＜0.01).TRPA1激动剂和拮抗剂可调节UVA、UVB所引起的钙离子内流的变化(P＜ 0.001),在UVA、UVB作用下,TRPA1激动剂组荧光强度均高于对照组(q值分别为14.934、32.770,P＜0.001),TRPA1抑制剂组荧光强度均低于对照组(q值分别为7.986、14.596,P＜0.001).结论 TRPA1在皮肤HaCaT细胞中有表达,UVA或UVB可通过TRPA1调控HaCaT细胞的钙离子内流.     

紫檀芪对长波紫外线辐射所致人成纤维细胞急性光损伤的保护作用

目的探讨紫檀芪(pterostilbene)对长波紫外线(UVA)辐射所致的人成纤维细胞急性损伤的保护作用,初步分析其分子机制。方法 MTT法测定紫檀芪对人皮肤成纤维细胞活力的影响,紫檀芪与人皮肤成纤维细胞共培养24h后,以20J/cm2的UVA剂量进行照射,然后采用乳酸脱氢酶释放法测定细胞活力,DCFH-DA测定胞内活性氧(cellular reactive oxygen species,ROS)水平,彗星实验检测DNA损伤,Western印迹检测核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor2,Nrf2)蛋白细胞定位以及siRNA沉默Nrf2。结果与对照相比,UVA照射后乳酸脱氢酶相对释放率增加为164.53%(P0.001)。而UVA照射前4μmol/L和8μmol/L紫檀芪预处理细胞24h,则细胞乳酸脱氢酶相对释放率分别恢复到对照组的100.11%(P0.05)和98.69%(P0.05)。流式细胞术分析显示,经UVA辐照后,其ROS水平上升至对照细胞的264.4%(P0.001),UVA照射前4μmol/L紫檀芪预处理细胞24h,则活性氧(ROS)水平恢复至对照细胞的113.50%(P0.05)。彗星实验结果显示,空白对照组细胞的尾部DNA百分比为(1.795±2.147)%,UVA辐照组为(65.50±12.418)%,与空白对照组相比DNA损伤显著增加(t=40.68,P0.000 1);而紫檀芪预处理后再接受UVA辐照组为(13.53±8.152)%,与UVA辐照组相比其DNA损伤显著减轻(t=27.85,P0.000 1)。紫檀芪处理提高了细胞核中的Nrf2蛋白水平。转染siRNA-Nrf2后,细胞活性与对照细胞差异无统计学意义(P0.05),但经UVA照射,紫檀芪的预处理细胞活性为对照组的35.32%(P0.000 1),紫檀芪的保护作用显著降低。结论紫檀芪能有效防御UVA所致成纤维细胞急性光损伤。这种保护作用可能与紫檀芪激活Nrf2信号通路相关。     

枸杞多糖对紫外线辐射HaCaT细胞急性损伤中Nrf2/Bach1通路的影响

目的探讨转录因子Nrf2/Bach1在枸杞多糖(LBP)防御紫外线(UV)致Ha Ca T细胞光损伤的作用。方法体外培养的Ha Ca T细胞经300μg/m L LBP预处理24 h后,分别接受30 J/cm~2UVA及300 m J/cm~2UVB照射,孵育24h。以噻唑蓝(MTT法)检测细胞增殖活性;尼罗红荧光染色法检测过氧化脂质含量;采用单细胞凝胶电泳法检测DNA损伤;RT-q PCR法检测Nrf2和Bach1 mRNA及下游II相解毒酶基因的表达,Western blot法检测Nrf2及Bach1蛋白在细胞内分布及表达情况。结果强度为30 J/cm~2UVA及300 m J/cm~2UVB均可造成Ha Ca T细胞增殖能力下降,过氧化脂质含量及DNA荧光强度、迁移距离增加,与空白组相比,差异均有统计学意义(P0.05);300μg/m L LBP预处理可显著提高细胞增殖活性,降低过氧化脂质水平,减轻DNA链断裂损伤,且增加Nrf2核蛋白及Bach1质蛋白的量,促进Nrf2 mRNA及下游II相解毒酶SOD,CAT,NQO1,GCLC,GCLM mRNA的表达,抑制Bach1mRNA的表达(均P0.05)。结论枸杞多糖可有效减轻UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤,其机制可能是通过激活Nrf2/Bach1转位及下游II相解毒酶基因的表达,发挥光防护作用。     

Nrf2基因对中波紫外线诱导角质形成细胞光损伤的保护作用

目的研究Nrf2基因对中波紫外线(UVB)诱导人永生化角质形成细胞(HaCaT)光损伤的保护作用。方法将培养的HaCaT细胞分为正常组、UVB组、Si-RNA组(Nrf2基因沉默组)和Si-RNA组+UVB组。以30 J/cm~2剂量的UVB照射细胞,观察Nrf2基因沉默后的HaCaT细胞经UVB照射后细胞形态的变化,用CCK-8方法检测细胞生存率,用流式细胞仪定量ROS检测,免疫印迹试验(Western-blot)检测Nrf2蛋白的表达情况。结果 CCK-8法检测结果显示,UVB组与正常组比较,细胞生存率降低;在Nrf2基因沉默后,HaCaT经UVB照射后细胞活力降低程度更显著,与UVB组比较,P 0.05。流式细胞仪检测Nrf2基因沉默后,HaCaT的ROS水平增加,其中Si RNA+UVB组ROS与Si RNA组和UVB组比较增加幅度更明显。Western-blot显示UVB组Nfr2蛋白表达较正常组降低(P 0.01),Si RNA组和Si RNA+UVB组的Nfr2蛋白表达显著降低,基因沉默表达,其中Si RNA+UVB组较Si RNA组,Nrf2蛋白表达降低(P 0.01)。结论 Nrf2基因沉默后,UVB诱导HaCaT细胞的氧化损伤和凋亡明显增加,表明Nrf2基因具有显著的光保护功效,其作用机制与增强细胞抗氧化能力、加速清除氧自由基有关。     

维生素B_2修饰的纳米酶对紫外线诱导HaCaT细胞氧化应激损伤的作用及机制

目的探讨维生素B_2修饰的纳米酶(VB_2-IONzymes)对中波紫外线(UVB)照射后HaCaT细胞氧化应激损伤的作用及可能的机制。方法 UVB照射诱导HaCaT细胞光损伤模型,将培养的HaCaT细胞分为空白组、UVB照射组、VB_2-IONzymes组、UVB+VB_2-IONzymes组。CCK-8检测HaCaT细胞增殖活性,酶生化法检测细胞醛缩酶(MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,ELISA法检测细胞中Nrf2及HO-1蛋白水平。结果 UVB照射组HaCaT细胞增殖活性显著降低,细胞MDA水平升高,SOD水平降低,Nrf2及HO-1蛋白表达下降,与空白组相比,差异均有统计学意义(P0.01);加入VB_2-IONzymes后,与UVB照射组相比,细胞活力明显提高(P0.05),细胞MDA水平显著降低,细胞内SOD水平、Nrf2及HO-1蛋白表达均显著上升(P均0.01)。结论 VB_2-IONzymes有抗氧化应激作用,其机制可能与促进Nrf2和HO-1表达相关。     

蜕皮甾酮对UVB诱导HaCaT细胞损伤的保护作用

目的探讨蜕皮甾酮(ecdysterone,EDS)对中波紫外线(UVB)诱导角质形成细胞损伤的保护作用及机制。方法将培养的HaCaT细胞分为正常对照组、UVB组、2.0μmol/L蜕皮甾酮剂量组(UVB+2.0μmol/L蜕皮甾酮),1.5μmol/L蜕皮甾酮剂量组(UVB+1.5μmol/L蜕皮甾酮),1.0μmol/L蜕皮甾酮剂量组(UVB+1.0μmol/L蜕皮甾酮);CCK-8法检测蜕皮甾酮对HaCaT细胞增殖能力的影响;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;采用PI单染和Annexin V-FITC/PI染色法,流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡率;比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)水平。Western印迹检测MMP-1,MMP-9,TIMP-1蛋白表达水平变化。结果在所选浓度范围内,蜕皮甾酮对HaCaT细胞的增殖无明显影响(P0.05)。与正常对照组比较,UVB组HaCaT细胞出现明显的凋亡形态,凋亡率明显增高;1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L蜕皮甾酮剂量组较UVB组凋亡细胞逐渐减少,差异有统计学意义(均P0.01)。与正常对照组相比,UVB组HaCaT细胞SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量升高(P0.01);1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L蜕皮甾酮剂量组与UVB组比较,SOD和GSH-Px活性增高,MDA含量下降(P0.01)。Western印迹显示:UVB组HaCaT细胞MMP-l,MMP-9蛋白表达量明显高于正常对照组(P0.01),而TIMP-l蛋白表达量低于正常对照组(P0.01);1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L蜕皮甾酮剂量组MMP-l,MMP-9表达量明显低于UVB组(P0.01),而TIMP-l表达量明显高于UVB组(P0.01)。结论蜕皮甾酮对中波紫外线诱导的HaCaT细胞凋亡,氧化损伤和光老化均具有一定的保护作用。     

Nrf2蛋白在中波紫外线照射HaCaT细胞中的光保护作用

【摘要】 目的 探讨Nrf2对中波紫外线（UVB）致HaCaT细胞光损伤的保护作用及其作用机制。方法 将培养的HaCaT细胞分为对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组，Nrf2组、Nrf2 + UVB细胞感染Nrf2基因过表达慢病毒，UVB组、Nrf2 + UVB组细胞以30 mJ/cm2的UVB照射30 s，继续培养24 h，观察UVB照射后HaCaT细胞形态的变化，Western印迹检测各组Nrf2蛋白水平，CCK8法检测各组细胞生存率，流式细胞仪检测各组细胞活性氧（ROS）水平，生化法检测超氧化物歧化酶（SOD）水平。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果 对照组 HaCaT 细胞形态为多角形、呈簇集状生长，UVB照射后细胞出现皱缩、变圆，漂浮细胞数增多，贴壁数量明显减少。对照组、UVB 组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组Nrf2蛋白相对表达水平分别为1.84 ± 0.047、0.63 ± 0.082、2.19 ± 0.168、1.43 ± 0.069，差异有统计学意义（F = 64.81，P < 0.05），Nrf2组水平高于对照组（t = 14.82，P < 0.05）；4组细胞生存率分别为98.00% ± 2.39%、24.40% ± 2.98%、71.63% ± 3.39%、43.38% ± 3.39%，差异有统计学意义（F = 236.66，P < 0.05），UVB 组细胞活力低于对照组（t = 33.34，P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 10.07，P < 0.05）；4组细胞的相对ROS含量分别为1.27 ± 0.10、5.65 ± 0.19、2.10 ± 0.73、3.67 ± 0.19，差异有统计学意义（F = 481.39，P < 0.05），UVB组高于对照组（t = 33.68，P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 12.47，P < 0.05）。4组细胞SOD水平差异有统计学意义（F = 170.76，P < 0.05），UVB组低于对照组（t = 11.25，P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 17.52，P < 0.05）。4组细胞IL-6水平差异有统计学意义（F = 532.34，P < 0.05），UVB 组高于对照组（t = 28.48，P < 0.05），Nrf2 + UVB组低于UVB 组（t = 27.82，P < 0.05）。4组细胞TNF-α水平差异无统计学意义（F = 2.02，P = 0.19）。结论 Nrf2可以通过降低细胞内ROS水平，提高内源性抗氧化酶SOD的活性，保护细胞免受UVB照射引起的氧化损伤。     

枸杞多糖粗提物对紫外线诱导HaCaT细胞清除活性氧的影响

目的 探讨枸杞多糖粗提物对紫外线诱导的HaCaT细胞清除活性氧(ROS)的影响及可能机制.方法 将HaCaT细胞分为空白组、枸杞多糖组、UVA组、UVB组、UVA+枸杞多糖组、UVB+枸杞多糖组.用噻唑蓝法检测细胞增殖活性;分光光度计检测枸杞多糖粗提物对UVA和UVB吸收情况;用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平;酶生化法测定胞质超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及乳酸脱氢酶(LDH)漏出量.结果 0、100、200、300、400、500、600、1 500、2 000 mg/L枸杞多糖粗提物对HaCaT细胞增殖活性无明显影响.枸杞多糖粗提物对280 ～400 nm紫外线透光率较大;与空白组比较,UVA和UVB组LDH漏出量、ROS水平显著升高,胞内SOD及GSH-Px活力降低,差异均有统计学意义(P＜0.001或0.05).照射前加枸杞多糖粗提物(UVA+枸杞多糖组、UVB+枸杞多糖组)可明显升高细胞内SOD、GSH-Px活性,减少LDH释放,降低ROS水平,与UVA或UVB组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 枸杞多糖粗提物不具有遮光剂的作用,但可有效清除ROS,降低LDH漏出率,抑制紫外线致HaCaT细胞光损伤,可能与其增强抗氧化酶活性有关.