磷酸二酯酶1A参与调节转化生长因子β_1诱导的血管外膜成纤维细胞胶原表达

目的探讨环核苷酸依赖的磷酸二酯酶1A(PDE1A)在转化生长因子β_1(TGF-β_1)诱导的血管外膜成纤维细胞(AF)Ⅰ型胶原表达中的作用。方法采用组织块贴壁法培养 SD 大鼠胸主动脉 AF。Bradford 方法测定蛋白浓度,免疫印迹技术观察Ⅰ型胶原和 PDE1A 蛋白表达,Leica Qwin 软件进行图像灰度分析。结果 1)TGF-β_1上调Ⅰ型胶原蛋白表达呈时间和剂量依赖性,以 TGF-β_1(10 ng/mL)诱导 AF 24 h 上调Ⅰ型胶原蛋白表达最强,较诱导前上调(147.5±38.7)%(P<0.05)。2)TGF-β_1上调 PDE1A 蛋白的表达呈时间和剂量依赖性,TGF-β_1(20ng/mL)诱导 AF 24 h PDE1A 蛋白表达量达(302.7±86.3)%,较诱导前显著上调(P<0.01);3)非特异性 PDE 抑制剂 IBMX 和特异性 PDE1A 抑制剂 IC86340均显著抑制 TGF-β_1诱导的Ⅰ型胶原的表达,抑制率分别达24.6%和15.8%,(P<0.05,P<0.05)。结论 PDE1A 参与 TGFβ-1诱导的血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原表达的调节。     

磷酸二酯酶1A参与调节转化生长因子β1诱导的血管外膜成纤维细胞胶原表达

目的 探讨环核苷酸依赖的磷酸二酯酶1A(PDE1A)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的血管外膜成纤维细胞(AF)Ⅰ型胶原表达中的作用.方法 采用组织块贴壁法培养SD大鼠胸主动脉AF.Bradford方法测定蛋白浓度,免疫印迹技术观察Ⅰ型胶原和PDE1A蛋白表达,Leica Qwin软件进行图像灰度分析.结果 1)TGF-β1上调Ⅰ型胶原蛋白表达呈时间和剂量依赖性,以TGF-β1 (10 ng/mL)诱导AF 24 h上调Ⅰ型胶原蛋白表达最强,较诱导前上调(147.5±38.7)%(P<0.05).2)TGF-β1上调PDE1A蛋白的表达呈时间和剂量依赖性,TGF-β1(20 ng/mL)诱导AF 24 h PDE1A蛋白表达量达(302.7±86.3)%,较诱导前显著上调(P<0.01);3)非特异性PDE抑制剂IBMX和特异性PDE1A抑制剂IC86340均显著抑制TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原的表达,抑制率分别达24.6%和15.8%,(P<0.05,P<0.05).结论 PDE1A参与TGFβ-1诱导的血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原表达的调节.     

氯沙坦对糖尿病大鼠肾小管间质TGF-β1和α-SMA的影响

目的 研究血管紧张素ⅡⅠ型受体拮抗剂(AT1RA)--氯沙坦对链脲佐菌素(STZ)大鼠肾小管间质转化生长因子-β1(TGF-β1)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.方法 用Wistar大鼠建立STZ诱导的糖尿病(DM)大鼠模型,设正常对照组(A),糖尿病组(B)和糖尿病+氯沙坦治疗组(C).用免疫组化方法检测肾小管间质TGF-β1和α-SMA蛋白的表达,RT-PCR检测TGF-β1mRNA.结果 TGF-β1和α-SMA在DM大鼠肾小管间质的表达较正常对照组显著升高(P＜0.05),C组与同期B组相比明显降低(P＜0.05).结论 氯沙坦能降低糖尿病大鼠肾小管间质TGF-β1和α-SMA的表达,缓解肾小管间质病理损害.     

吡非尼酮抑制转化生长因子β1/转化生长因子活化激酶1通路改善大鼠腹膜纤维化

目的观察吡非尼酮(PFD)对高糖诱导大鼠的腹膜纤维化(PF)的影响,并探讨其分子作用机制。方法雄性SD大鼠腹腔注射4.25%腹膜透析液100 mL/(kg·d),连续4周,建立PF大鼠模型;随机分为4组:空白对照组、PF组、PF+PFD 250 mg/(kg·d)(PF-PFD250组)、PF+PFD 750 mg/(kg·d)(PF-PFD750组)。检测超滤量(UFV)及最大葡萄糖转运量(MTG),代表腹膜转运功能;Masson染色观察腹膜胶原沉积;免疫组化法测壁层腹膜中转化生长因子β_1(TGF-β_1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及E-钙黏蛋白表达;免疫印迹试验(Western-blot)检测腹膜组织TGF-β_1、α-SMA、E-钙黏蛋白、Ⅰ型胶原、转化生长因子活化激酶1(TAK1)/磷酸化TAK1(P-TAK1)、P38/磷酸化P38(P-P38)蛋白的表达。体外培养腹膜间皮细胞(PMCs),并分别使用TGF-β_1、TGF-β_1+PFD、TGF-β_1+P-P38抑制剂(SB203580 20 nmol/L)进行干预。细胞计数试剂(CCK8)评估细胞活力;Western-blot测细胞α-SMA、E-钙黏蛋白、Ⅰ型胶原、TAK1/P-TAK1、P38/P-P38蛋白表达。结果与空白对照组相比,PF组超滤量减少[(1.588±0.955)比(9.675±2.626)mL,P0.01],MTG升高[(18.625±3.042)比(8.880±1.940)mmol/kg,P0.01],腹膜厚度明显增加(P0.01);与PF组相比,PF-PFD250组及PF-PFD750组超滤量增加,MTG降低,腹膜厚度降低(均P0.01)。与空白对照组相比,PF组腹膜组织中TGF-β_1、Ⅰ型胶原、P-TAK1、P-P38、α-SMA表达水平升高,E-钙黏蛋白表达水平降低(均P0.01);PFD可抑制PF大鼠腹膜组织TGF-β_1、α-SMA、Ⅰ型胶原、P-TAK1、P-P38蛋白表达,促进E-钙黏蛋白的表达(P0.01)。与空白对照组相比,TGF-β_1(5μg/L)组细胞活力明显降低(P0.01),P-TAK1、P-P38、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白水平增加,E-钙黏蛋白表达减少(均P0.01);与TGF-β_1组相比,TGF-β_1+PFD(10~(-3) mol/L)组和TGF-β_1+P-P38抑制剂组细胞活力增加,α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白水平降低,E-钙黏蛋白表达升高(均P0.01);TGF-β_1+PFD组中P-TAK1和P-P38表达均减少;而TGF-β_1+P-P38抑制剂组中仅P-P38表达减少(均P0.01)。结论吡非尼酮可减轻高糖诱导的大鼠腹膜间皮下致密层增厚,抑制腹膜上皮-间充质转分化,从而改善PF,这种保护作用可能是通过抑制TGF-β_1/TAK1信号通路而实现的。     

高迁移率族蛋白A1在转化生长因子β诱导的人脐静脉内皮间质转化中的作用

目的研究高迁移率族蛋白(HMG)A1在转化生长因子β(TGF-β)诱导的人脐静脉内皮间质转化中的作用机制。方法选择人脐静脉内皮细胞(HUVEC)随机分组:(1)空白模型组和空白对照组,分别采用10 ng/ml的TGF-β和等体积PBS刺激72 h;(2)对照1组[携带绿色荧光蛋白的腺相关病毒(AAV9-GFP)+PBS],HMGA1组(AAV9-HMGA1+PBS),模型1组(AAV9-GFP+TGF-β),实验1组(AAV9-HMGA1+TGF-β),各组细胞进行AAV9-HMGA1或AAV9-GFP转染后,给予TGF-β或PBS刺激72 h;(3)对照2组[阴性对照siRNA(si-NC)+PBS],si-HMGA1组[靶向HMGA1的小干扰RNA(si-HMGA1)+PBS],模型2组(si-NC+TGF-β),实验2组(si-HMGA1+TGF-β),各组细胞转染后,给予TGF-β或PBS刺激72 h。检测各组HMGA1、CD31、CD34、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白、β连环蛋白(β-catenin)表达。结果与空白对照组比较,空白模型组HMGA1蛋白表达明显增加(0.33±0.03 vs 0.19±0.01,P0.05)。HMGA1组HMGA1蛋白表达水平明显高于对照1组(0.73±0.09 vs 0.19±0.02,P0.05)。与模型1组比较,实验1组HUVEC的CD31荧光强度明显减弱,波形蛋白荧光强度明显增强(P0.05)。与模型1组比较,实验1组CD31和CD34蛋白表达明显降低,α-SMA、波形蛋白及β-catenin表达显著上调(P0.05)。与对照2组比较,si-HMGA1组HMGA1蛋白表达明显下调(P0.05);与模型2组比较,实验2组CD31表达上调,α-SMA和β-catenin表达下调(P0.05)。结论 TGF-β可以诱导HUVEC的HMGA1表达上调,并且HMGA1通过Wnt/β-catenin信号通路促进内皮间质转化。     

p16INK4a基因通过非周期依赖作用促进心脏成纤维细胞纤维化蛋白表达

目的:探究p16INK4a基因在转化生长因子-β1 (TGF-β1)介导的促心肌纤维化中的作用及机制.方法:在人原代心脏成纤维细胞中转染p16INK4a过表达腺病毒,TGF-β1刺激并检测胶原蛋白(Collagen)Ⅰ、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和骨膜蛋白(POSTN)蛋白表达水平.其次,TGF-β1刺激细胞后,...     

瘦素对乙醛诱导肝星状细胞活化过程中Ⅰ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的:观察瘦素对乙醛诱导肝星状细胞(HSC)活化过程中α-SMA和I型胶原表达的影响,旨在从体外探讨瘦素在酒精性肝病中的可能作用。方法:采用SD大鼠肝脏原位灌流消化的方法获得并原代及传代培养HSC,分乙醛(200μmol/L)处理组,瘦素(100nmol/L)处理组及联合处理组(乙醛200μmol/L加瘦素100nmol/L)。用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞α-SMA表达量,ELISA法检测培养上清中TGF-β1及Ⅰ型胶原含量。结果:①乙醛处理组中TGF-β1和Ⅰ型胶原基因及蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.05),α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);②瘦素处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);③联合处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量明显高于对照组(P<0.05),但TGF-β1、Ⅰ型胶原表达量与乙醛处理组相比差异无显著性意义(P>0.05)。结论:在乙醛诱导肝星状细胞活化过程中,瘦素能协同上调α-SMA的表达;但对TGF-β1及Ⅰ型胶原的表达无影响,Ⅰ型胶原和α-SMA的表达可能是依赖于不同的调控机制来实现。     

转化生长因子-β1对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响,同时观察TGF-β1对肾小管上皮细胞合成细胞外基质(ECM)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响.方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,观察TGF-β1诱导人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)合成CTGF、ECM、TIMP-1及α-SMA的情况.结果:在无TGF-β1刺激的情况下,HK-2细胞中有基础量的CTGF mRNA表达,TGF-β1以剂量和时间依赖的方式诱导HK-2细胞合成CTGF mRNA,其表达在24h时达高峰,同时TGF-β1可使HK-2细胞合成ECM、α-SMA增多,但在时相上均晚于CTGF.随着TGF-β1浓度的增加,HK-2细胞合成TIMP-1也随之增加,但较大剂量的TGF-β1(15ng/ml)方可使TIMP-1 mRNA的表达明显增加(P＜0.05).结论:TGF-β1可直接诱导体外培养的人近端肾小管上皮细胞表达CTGF,其表达转录水平要早于ECM、α-SMA的表达,提示CTGF可能介导了TGF-β1的促肾小管上皮细胞ECM合成和转分化的作用.     

低密度脂蛋白诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用机制研究

目的探讨低密度脂蛋白(LDL)对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化的影响及其作用机制。方法将体外培养的NRK-52E细胞分为4组:正常对照组、洛伐他汀(Lov,1μmol/L)组、LDL(250 mg/L)刺激组、LDL(250mg/L)+Lov(1μmol/L)组。应用倒置显微镜观察细胞形态学改变;RT-PCR检测NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3和整合素链接酶(ILK)mRNA表达;West-ern blot检测α-SMA、E-cadherin及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白表达;ELISA检测上清液TGF-β1。结果加入LDL培养24 h后,NRK-52E细胞由立方形或多角形变为长梭形,α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3和ILK mRNA的表达上调,E-cadherin mRNA的表达下调,与对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);α-SMA和p-Smad2/3蛋白表达量显著高于对照组(P0.01),E-cadherin蛋白表达量显著低于对照组(P0.01);细胞上清液TGF-β1浓度显著高于对照组(P0.01)。LDL+Lov组与LDL组比较,NRK-52E细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、ILK mRNA的表达及α-SMA、p-Smad2/3的蛋白表达均明显降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达明显增强。结论LDL可诱导肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是激活TGF-β1/Smads/ILK信号通路,而Lov能部分阻断LDL诱导的小管上皮细胞转分化。     

硫化氢对高糖腹膜透析液诱导大鼠腹膜结构和功能损伤的影响

目的:观察硫化氢(H_2S)对高糖腹膜透析液诱导大鼠腹膜结构和功能损伤的影响。方法:SD大鼠随机分为四组(对照组、单独H_2S组、模型组及治疗组)。第28天行腹膜平衡试验;取壁层腹膜组织观察腹膜结构变化,检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅲ(Col-Ⅲ)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达情况。检测大鼠腹膜间皮细胞单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、α-SMA、E-钙黏素(E-cadherin)和TGF-β1 mRNA表达情况。结果:与对照组相比,模型组腹膜增厚伴血管增生、炎症细胞浸润增加,且间皮下α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表达显著增加(P0.05);与模型组相比,治疗组腹膜形态明显改善,α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表达显著减少(P0.05)。与对照组相比,模型组超滤量显著减少,腹膜通透性显著升高,治疗组大鼠腹膜转运功能显著改善(P0.05)。2.5%葡萄糖透析液刺激腹膜间皮细胞12h使肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA表达显著增加、上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达显著减少,同时MCP-1、IL-6、ICAM-1和TGF-β1 mRNA表达显著增加(P0.01);透析液中加入100μmol/L、300μmol/L NaHS可显著抑制上述炎症因子及纤维化因子表达(P0.01)。结论:在腹膜透析液中加入外源性H_2S可显著改善腹膜结构及功能损伤,并可部分逆转腹膜间皮细胞转分化,进而减少炎症因子和纤维化因子合成。