种子果实类中药DNA条形码鉴定的研究进展

中药材的现代鉴别方法结合了多学科,包括细胞生物学、分子生物学、遗传学等,与传统鉴别方法比较消除了外观因素的干扰,通过DNA条形码技术从生物学上进行鉴别,使鉴别结果更加准确、可靠.DNA条形码技术将随机PCR扩增,让每一种基因组DNA序列均有独特的单一的结合位点,通过PCR扩增产物检测能够找到基因组DNA的多态性区域,利...     

中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究

目的：建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要。方法: 以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出最优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测。结果：改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90%。结论：通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

中药DNA条形码鉴定体系及研究方向

近年来,中药DNA条形码分子鉴定得到快速发展,加快了中药鉴定标准化的进程。通过中药DNA条形码鉴定研究,我国首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列,并建立以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI序列为核心、ITS2为辅助序列的动物类药材DNA条形码鉴定体系,为中药DNA条形码鉴定的发展奠定了坚实基础。本文结合课题组研究工作就构建中药DNA条形码鉴定体系进行了综述,包括中药DNA条形码序列的筛选确定、中药DNA条形码鉴定流程和中药DNA条形码鉴定数据库系统构建,并介绍了中药DNA条形码鉴定的研究方向。     

适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法的研究

目的 建立适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法.方法 以6种富含次生代谢物质的药用顽拗植物为材料,对7种DNA提取方法进行比较.结果 CTAB法3对中药材具有通用性,操作简便、快速,提取的DNA浓度和合格率比其他对照方法高,能满足DNA条形码PCR扩增的要求.该方法主要特点:(1)用3%的CTAB浓度代替常用的2%CTAB;(2)采用1%的PVP与0.2%β-巯基乙醇共同去除杂质和防止DNA降解;(3)采用10000 r/min离心15 min去除蛋白质等杂质.结论 CTAB法3是适合中药材DNA条形码研究的DNA提取方法.     

基于DNA条形码鉴定豆蔻类中药材

目的：利用ITS2序列对豆蔻类中药材进行DNA条形码鉴定研究。方法：本文采集了包括豆蔻两个基原白豆蔻Amomum kravanh与爪哇白豆蔻Amomum compactum、红豆蔻Alpinia galanga、草豆蔻Alpinia katsumadai等在内的70份样品,采用试剂盒法提取基因组DNA,应用Primer premier 5.0设计引物,通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增其ITS2序列,并对PCR产物进行双向测序,所得序列经CodonCode Aligner V3.71拼接后,采用MEGA5.0 软件进行序列比对,计算种内和种间距离,构建邻接树（Neighbor-joining tree,NJ Tree）。ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov model,HMM）的注释方法获得。结果：通过新设计引物扩增的序列可以注释到5.8 S与28 S,扩增序列位于ITS2间隔区。采用新设计的引物,所有实验样品均可获得ITS2序列,NJ树结果显示不同种豆蔻类药材分别聚为一支,可以互相区分,且可以与其混伪品相互区分。另外,通过序列比对发现有5个SNP（s）存在于豆蔻与其它物种种间,且有2个稳定的SNP（s）存在于白豆蔻和爪哇白豆蔻种间,可用于二者的准确鉴定。结论：ITS2序列作为DNA条形码可准确稳定地鉴别不同种豆蔻类药材,本研究将为保障临床安全用药提供新的技术手段。     

近年来DNA微型条形码和DNA宏条形码在中药鉴定中的应用

中药鉴定是保证中药有效性和安全性的重要一环。DNA条形码技术让中药鉴定摆脱了经验依赖,弥补了传统化学方法和形态学方法鉴定中药材的不足,然而对于在炮制或加工过程中DNA降解的药材和复杂样品方面鉴定能力有限。中药DNA条形码鉴定技术近年来发展迅速,DNA微型条形码的出现,不仅可用于鉴定DNA发生严重降解的实验材料,在很大程度上弥补了传统条形码的短板,还可作为候选条形码,与标准条形码组合,共同鉴定混合中药材样本。此外,DNA宏条形码技术通过将DNA条形码与高通量测序技术相结合,以实现组合样本中多个物种的检测,是目前混合中药材鉴定方面最有效的分子鉴定方法。该文通过对近年来DNA微型条形码、DNA宏条形码在有关中药物种及中药共存微生物组成鉴定的研究进行梳理总结,以明晰该领域研究现状,并展望未来发展,为中药分子鉴定研究提供参考。     

基于DNA条形码的藤类药材鉴定

目的:对《中国药典》中记载的14种藤类药材进行分子鉴定。方法:以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。结果:14种藤类药材的ITS2序列长度为190-284 bp;各药材种内K2P遗传距离为0-0.053,远远小于种间K2P遗传距离(平均值为0.852,最小值为0.309);由所构建的系统聚类树图可以看出,本研究中具有不同产地来源样品的药材均表现出了单系性,同时又与其它药材明显分开。结论:ITS2序列作为条形码适用于鉴定《中国药典》中藤类药材,在中药材的鉴定领域具有重要的应用前景。     

溪黄草DNA 条形码鉴定研究

目的：研究DNA条形码技术在溪黄草药材品种鉴定中的适用性。方法：选取rbcL、psbA -trnH、matK 和ITS2 等4 个条形码标记,对41 份溪黄草药材样品（含溪黄草Rabdosia serra、线纹香茶菜R. lo原phanthoides 和纤花香茶菜R. ophanthoides var. graciliflora）进行DNA 提取、PCR 扩增及双向测序,对测序结果进行质量检查、人工校对和序列拼接获取标准碱基序列信息,通过比较序列获得成功率以及物种鉴定力（TaxonGap 法）,筛选适合溪黄草基原鉴定的DNA 条形码序列。结果：条形码序列获得成功率依次为rbcL（100%）、psbA -trnH（90.2%）、ITS2（87.8%）和matK（70.7%）;物种鉴定力方面,rbcL、psbA -trnH 和ITS2 等3条序列均可有效鉴定不同物种,但不适于分辨种下单位。结论：综合考察序列易得性和物种鉴定力,rbcL可作为溪黄草品种鉴定的首选条形码。     

通用中药DNA条形码鉴定系统的研究及应用

为了对特殊身份的物种或品种进行保护、检测转基因生物,以及追踪生物的扩散,对所采集生物样本的来源物种进行准确地识别是非常必要的。简而言之,条形码物种鉴定技术即通过大范围地对一个或多个参考基因进行筛选,从而达到将未知个体归属于某个分类单元的目的,其使用通用的PCR引物对物种特异性的DNA条形码识别区进行扩增,将扩增产物的测序结果与数据库进行比较即可确定物种的身份。此项技术的推广尚面临2个关键问题：①如何进一步使用和分析DNA条形码数据;②如何建立起DNA条形码与经典分类方法之间的关联。本文结合上述问题对DNA条形码技术的原理和应用进行了综述。     

通用中药DNA条形码鉴定系统的研究及应用

为了对特殊身份的物种或品种进行保护、检测转基因生物,以及追踪生物的扩散,对所采集生物样本的来源物种进行准确地识别是非常必要的.简而言之,条形码物种鉴定技术即通过大范围地对一个或多个参考基因进行筛选,从而达到将未知个体归属于某个分类单元的目的,其使用通用的PCR引物对物种特异性的DNA条形码识别区进行扩增,将扩增产物的测序结果与数据库进行比较即可确定物种的身份.此项技术的推广尚面临2个关键问题:①如何进一步使用和分析DNA条形码数据;②如何建立起DNA条形码与经典分类方法之间的关联.本文结合上述问题对DNA条形码技术的原理和应用进行了综述.     

燕窝DNA条形码的鉴定研究

应用Cytb序列对燕窝进行DNA条形码(DNA barcodes)研究,为燕窝的溯源研究及全面评价燕窝质量提供理论依据。以马来西亚、印度尼西亚、越南、泰国等地的燕窝,共计39个样本为研究对象,提取基因组DNA,扩增Cytb序列并双向测序。采用MEGA 7.0软件,对39条样本序列及36条从Gen Bank中下载5种金丝燕的Cytb序列进行序列特征分析,基于Kimura双参数法计算序列种内、种间遗传距离,构建NJ和UPGMA系统聚类树进行分析。研究结果表明,39个样本共来源于3个不同的金丝燕物种。Cytb序列种间变异显著大于其种内变异,可以准确地区分不同种类的燕窝。所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开。表明基于Cytb序列的DNA条形码技术可用于准确快速地鉴别燕窝的生物基原。     

酸枣仁的DNA条形码鉴定研究

目的:采用psbA-trnH序列对药食同源药材酸枣仁进行鉴定。方法:提取酸枣仁药材及其混伪品的DNA,对psbA-trnH序列进行扩增和双向测序分析。将拼接后序列进行多序列比对分析,计算物种的种内、种间kimura 2-parameter(K2P)遗传距离,并构建系统聚类树。结果:酸枣仁药材的psbA-trnH序列比对后长度为336 bp;酸枣仁的种内最大K2P遗传距离为0.017,小于酸枣仁与混伪品的最小种间K2P遗传距离;基于psbA-trnH序列构建的NJ树表现出良好单系性,酸枣仁与混伪品明显区分开。结论:采用psbA-trnH序列可有效地鉴定药食同源药材酸枣仁。     

艾叶的DNA条形码鉴定研究

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥叶,常用于艾灸、中药临床等。由于艾属植物形态特征的相似性,使艾叶难以快速地鉴定,不利于药材流通管理规范化以及用药安全。基于ITS2序列以及psbA-trnH序列,从分子水平对艾叶及其近缘种的15个蒿属植物进行鉴定分析。研究结果表明,艾叶及其近缘种的基因组DNA较容易提取得到,提取率为100%,PCR扩增,测序后能够得到稳定的ITS2片段以及psbA-trnH片段。根据序列特征、K2P遗传距离、聚类树的分析结果分析,相对于psbA-trnH以及ITS2+psbA-trnH序列,ITS2序列更适用于鉴定艾叶及其近缘种或混伪品,是鉴定艾叶的理想条形码。56批艾叶样本的ITS2序列比对后长度为225bp,种内暂未发现变异位点,种间最大遗传距离为0,艾叶与其混伪品间的最大种内距离小于最小种间距离0.005。以邻接法、最大简约法、最大似然法估计构建系统聚类树的结果表明,56条艾叶ITS2序列独自聚为一支,表现出良好的单系性,与其混伪品能够很好地区分。同时,除了东亚栉齿蒿、大籽蒿之外,艾叶近缘种以及混伪品之间也都能各自单独聚为一支,单系性良好,能够很好地与艾叶区分开。因此,ITS2序列可用于鉴定其近缘种及其混伪品,是基于分子条形码技术鉴定的理想序列。     

中药络石藤及其习用品的DNA条形码鉴定

目的：本研究应用ITS2序列鉴定区分络石藤及其习用品广东络石藤、地瓜藤、薜荔藤和扶芳藤。方法：提取以上5种中药基原植物基因组DNA,扩增不同样品的ITS2序列。采用隐马尔科夫模型HMMer进行序列注释,ClustalW法进行序列比对,K2P模型计算种内和种间遗传距离分析,邻接法和最大似然法构建进化树。结果：5个物种的ITS2序列长度各不相同,在220-243bp之间。遗传距离分析显示,5个物种的最大种内遗传距离为0.038,最小种间遗传距离为0.113,最大种内遗传距离大于最小种间遗传距离。同时5个物种可以在进化树上区分开来。结论：ITS2序列可以用于中药络石藤及其习用品的分子鉴定,为准确区分该类药材提供新的技术手段。     

黄精属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的：评价DNA条形码候选序列对黄精属药用植物的鉴定能力。方法：对44份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH及核ITS2和ITS序列,分析其种内种间变异和barcoding gap,应用BLAST和Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果：ITS2和ITS序列通用引物扩增效率低,叶绿体matK序列获得率最低,rbcL最高,三条序列种内与种间变异均较小,无明显的barcoding gap。基于BLAST和Nearest Distance方法计算,三条叶绿体序列对黄精属药用植物的鉴定效率均较低。结论：DNA条形码候选序列psbA-trnH、matK及rbcL不适用于黄精属药用植物的鉴定,叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。     

全蝎DNA条形码分子鉴定研究

目的:本研究通过COI序列对全蝎及其混伪品进行DNA条形码鉴别,为全蝎药材分子鉴定提供科学依据。方法:通过野外采集东亚钳蝎正品,对采集样品形态学鉴定、DNA提取、PCR扩增COI序列,测序建立东亚钳蝎的正品COI数据库,通过比对确定东亚钳蝎正品和伪品的DNA条形码。结果:实验共获取310份东亚钳蝎样本。通过序列分析,确定东亚钳蝎COI序列长度为658 bp。采用MEGA 6.0软件对东亚钳蝎样品及混伪品进行序列比对,构建邻接(NJ)树。结果表明东亚钳蝎COI序列扩增成功,与混伪品COI序列明显区分。结论:本研究运用COI条形码序列可准确鉴定全蝎的基原动物及其混伪品,为后续全蝎药材的分子鉴定提供了新的可行性方法。     

《中药DNA条形码分子鉴定》即将出版

《中药DNA条形码分子鉴定》由国际科技合作项目和卫生行业科研专项资助,中国医学科学院药用植物研究所陈士林研究员等编著,人民卫生出版社即将出版。该书首次系统介绍了中药DNA条形码分子鉴定技术的原理、方法、技术流程及应用,并选取208种常用中药材和1000余种混伪品和近缘物种进行了DNA条形码鉴定,既有概念和理论,又有技术手段和案例的分析。     

DNA条形码技术在中药鉴定中的应用进展

DNA条形码(DNA barcoding)技术利用标准的一个或多个DNA片段对物种进行鉴定,是近年来生物学研究的热点领域,也是生物学发展最迅速的方向之一。总结了植物DNA条形码研究的发展历程及最新进展,重点讨论了超级条形码在近缘物种鉴别中的应用前景,以及DNA条形码在中药材基原物种鉴定、道地药材鉴别以及中药材溯源系统研究中的应用,并强调了植物DNA条形码在中药资源评价、保护和可持续利用中的重要地位和作用,为药用植物DNA条形码研究提供新的思路。     

木麻黄属的DNA 条形码鉴定研究

为验证DNA条形码序列在物种鉴定方面及物种的系统发育方面的广适性,本研究以黎药植物木麻黄为研究对象,收集木麻黄及其近缘种和混伪品22份样本,采用4对引物(ITS,ITS2,trnH-psbA,rbcL)分别进行PCR扩增,产物进行双向测序。利用CodonCode Aligner软件进行序列的拼接,采用MEGA5.1进行数据的处理。结果表明,利用ITS/ITS2可以区分木麻黄与其近缘种以及混伪品,样品的psbA-trnH,rbcL和ITS/ITS2 4个序列中,ITS/ITS2序列具有明显的DNA gap。基于ITS/ITS2序列构建的NJ树结果表明,木麻黄属所有样品聚为一类,呈现明显的单系性,与其亲缘关系较近的是藤黄科。因此,ITS/ITS2序列可以准确鉴定黎药的基原植物。并能从分子水平揭示木麻黄的系统演化规律。