EGFR外显子19、21突变等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的 建立一种人表皮生成因子受体(EGFR)外显子19、21突变等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)检测方法.方法 根据EGFR外显子19、21野生型和突变型设计特异性引物,提取健康人和非小细胞肺癌患者血中有核细胞的基因组DNA作为模板,采用等位基因特异性聚合酶链式反应扩增EGFR外显子19、21突变基因.结果 特异性引物可以扩增EGFR外显子19缺失突变的2种类型和外显子21的错义突变.结论 等位基因特异性PCR法可以用于检测人EGFR外显子19、21突变.     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法。方法根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqM an探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究。结果该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10 cfu/mL。反应体系具有很高的稳定性。结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值。     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的 探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法.方法 根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqMan探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究.结果 该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10cfu/mL.反应体系具有很高的稳定性.结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值.     

聚合酶链反应检测稳定L型结核分枝杆菌

目的探讨聚合酶链反应(PCR)在结核分枝杆菌稳定L型检测的应用价值.方法采用结核分枝杆菌染色体基因重复保守序列为引物的PCR诊断试剂检测非高渗培养的结核分枝杆菌稳定L型纯培养物的染色体DNA.结果结核分枝杆菌稳定L型的染色体DNA经PCR扩增后电泳可见2条DNA带,其中1条主带与其亲代细菌型一致,另1条为相对分子质量较小的次带.结论结核分枝杆菌稳定L型仍保留了与细菌型染色体PCR引物反应的特异性序列和出现1条相对小分子质量的带,但仍然可用结核分枝杆菌PCR对其进行特异性检测与鉴定.     

多聚酶链反应技术及其在临床血液学上的应用

多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外由引物(primers)介导的特定DNA序列的酶扩增,又称基因扩增.这种技术能在数小时内合成一百多万个特定DNA序列考贝,既敏感,又快速、方便.因此,虽然PCR于1985年底首见报道,但其应用日趋广泛.本文就PCR原理、基本过程及其在临床血液学上的应用作一综述.PCR原理PCR扩增的DNA片段的特异性基于两个寡核苷酸引物,这两个引物位于待扩增的DNA片段的两侧,并与相应的DNA链互补.该过程包括:DNA热变性使之成为单链状,然后退火,使引物连接于与引物互补的特定DNA链上,再在DNA多聚酶的作用     

一种可消除非特异性条带高精度、多用途的PCR方法

目的 建立一种可消除RT-PCR反应中非特异条带生成，提高PCR反应的精确度的PCR体系。方法 比较普通RT-PCR反应与硫化修饰引物结合不同校正活性聚合酶对非特异性扩增的抑制能力。结果 引物3′末端硫化修饰结合具有校正活性的聚合酶可特异性关闭PCR反应中引物3′末端与模板非特异结合而引起的非特异性扩增，只允许引物3′末端与模板完全匹配的延伸反应得以进行。结论 利用校正聚合酶是严格模板依赖型校正活性酶的特点，将引物3′末端硫化修饰后，由于校正聚合酶在PCR延伸开始之前首先会依据模板检查引物是否完全与模板匹配，如果不匹配则将根据模板先将引物修改得和模板一致后才允许延伸的特性，而引物3′端引入抗酶切的硫化修饰后，引物与模板非特异结合将由于校正活性聚合酶长期停留在试图纠正引物与模板不一致状态而得不到有效延伸，从而只允许引物与模板完全匹配的延伸得以扩增，大大提高了PCR反应的特异性。     

PCR技术在淋巴系统恶性肿瘤患者MRD检测中的应用

基于PCR技术检测MRD的方法多种多样 ,如共同引物和特异引物PCR ,RT PCR ,ASO PCR ,SSCP PCR ,荧光PCR结合毛细管电泳技术以及定量的竞争PCR和实时定量PCR(RQ PCR)、LightCycleRQ PCR等。各种方法均有其优缺点及适用情况 ,合理选择才能获得所需的灵敏度和特异性     

PCR检测血小板细菌的引物设计与筛选

目的设计PCR检测血小板细菌的通用引物,评价其在血小板检测中的应用效果。方法在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中找到不同细菌中同一片段基因16Sr DNA序列,对其做多序列比对,确定合适的保守区域;使用Primer 5.0设计3对引物探针,采用荧光定量PCR对不同浓度[(101—107)CFU/m L]的标准菌株扩增,通过分析扩增曲线来判断扩增效果。分别将配制后经血小板稀释为101、102、103、104、105、106、107CFU/m L的菌悬液在22℃震荡培养24 h,以荧光定量PCR检测细菌;筛选出灵敏度和特异性最好的引物作为最终引物。结果血小板常见菌做荧光定量PCR检测[对(101—107)CFU/m L的细菌重复检测3次]后,通过对检测灵敏度和特异性的比较,发现第3号组引物(16S-F3:CAACGCG■AACCTTAC,16S-R3:AACC■CATTTCACAACA)不但能避免背景和非特异物的产生,而且能识别低含量的目标DNA,检测的细菌浓度范围含量为(102—108)CFU/m L。结论细菌通用引物的设计与筛选为血小板细菌的核酸检测方法的建立起到了关键的作用。     

118株单核细胞增生李斯特菌的毒力基因检测

目的 了解中国单核细胞增生李斯特菌(Lm)的毒力基因分布情况.方法 对Lm的6个毒力基因(hly、prfA、plcB、inlA、actA、iap)分别设计聚合酶链反应(PCR)引物,建立PCR检测方法.对hly、plcB、iap 3个基因的PCR方法进行了特异性试验.结果 对国内多个地区多种来源的118株Lm进行了PCR检测,结果表明除2株菌不含prfA基因外,其他菌株均包含6个毒力基因.PCR引物特异性试验结果表明hly、plcB、iap3个基因的PCR引物特异性良好,可用于Lm的鉴定.结论 Lm普遍具有毒力基因,具有潜在的爆发风险,应加强对其监测.     

套式聚合酶链式反应诊断三日疟原虫感染的临床应用

目的应用套式聚合酶链式反应(PCR)扩增小亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)基因诊断三日疟原虫感染,以减少三日疟的漏诊和误诊。 方法分别提取可疑三日疟患者抗凝血DNA和对照间日疟、恶性疟患者抗凝血DNA,以此为模板,用疟原虫属特异性引物进行第一轮扩增;然后以第一轮扩增产物为模板,用4种疟疾的种特异性引物进行第二轮扩增,比较扩增出的18 SSU rRNA基因片段的大小,并对目的片段进行测序鉴定。 结果经属特异性引物PCR扩增后,3个样本均出现大小约为1200bp的条带。经种特异性引物PCR扩增后,间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的120bp和205bp特异性条带;可疑患者样本仅在用三日疟原虫种特异性作引物时扩增出144bp特异条带,与理论值相符,与Genbank标准序列对比显示,扩增片段大小及测序结果均完全正确。证实患者感染三日疟原虫。 结论利用小亚单位核糖体核糖核酸基因片段三日疟种特异引物进行扩增可以用于诊断三日疟原虫感染。     

基于多重PCR的多样本混合检测低频等位基因Di~a和Co~b

目的建立可同时检测低频等位基因Dia和Cob,并且可进行多个样本混合检测的多重PCR基因分型方法。方法针对血型抗原Dia和Cob等位基因的单个核苷酸多态性(SNP)位点分别设计序列特异性引物,建立稳定的多重PCR体系。通过优化引物设计及PCR反应条件,提高多重PCR反应的灵敏度,使其可同时检测5~10份DNA标本。应用     

四维杂交液检测HBV DNA结果中出现的假阳性信号

基层医院实验室通常是购买成品的PCR试剂盒来检测HBVDNA含量,成品的PCR试剂盒往往是按照纯净的单一序列DNA经优化实验得到的,其特异性是由两段引物和一个探针（Taqman定量）共三段特异核酸序列保证的,而临床样本中成分非常复杂,由其提取的总核酸包罗各种序列的DNA或RNA,很容易出现非特异性假阳性信号,     

PCR技术在淋巴系统恶性肿瘤患者MRD检测中的应用

基于PCR技术检测MRD的方法多种多样，如共同引物和特异引物PCR，RT-PCR，ASO-PCR，SSCP-PCR，荧光PCR结合毛细管电泳技术以及定量的竞争PCR和实时定量．PCR(RQ-PCR)、LightCycle RQ-PCR等。各种方法均有其优缺点及适用情况，合理选择才能获得所需的灵敏度和特异性。     

引物标记技术在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用

目的在GeXP系统中应用CY5标记的特异引物代替通用引物,建立一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法设计mecA与nuc基因引物,经聚合酶链反应(PCR)扩增琼脂糖电泳验证引物特异性并优化PCR反应条件。用荧光染料CY5标记单条引物(单独标记上游或下游引物)。以提取的MRSA、甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)核酸为模板液,采用已标记引物进行单重及多重PCR,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳分析,验证应用效果。再通过采用混合标记引物的GeXP系统检测100株MRSA,分析其应用效果。结果单标记下游引物的GeXP-PCR的杂质扩增峰较少。经GeXP系统检测分析的MRSA、MRCNS、MSSA均出现目的特征峰,能明确辨别其含有大小不同的基因片段,结果与琼脂糖电泳一致;经GeXP系统分析的100株MRSA均含有nuc与mecA片段,与VITEKⅡCompact检测结果相符。结论单独标记下游引物应用于GeXP检测MRSA的方法可行。     

人类血小板抗原1～4系统基因分型

目的 :建立人类血小板抗原 1～ 4系统序列特异性引物 (PCR SSP)分型方法。方法 :合成 14条引物 ,采用PCR SSP方法对 2 5名健康献血者的HPA 1～ 4系统进行基因分型 ;分型结果与采用等位基因特异性寡核苷酸点杂交 (PCR ASO)获得的结果进行比较。结果 :以PCR SSP方法对HPA 4个系统进行分型均取得了明确、满意的结果 ,且与PCR ASO方法获得的结果完全一致。结论 :人类血小板抗原PCR SSP基因分型方法具有简便、快速、准确等优点 ,具有广泛的应用前景。     

四维杂交液检测HBVDNA结果中出现的假阳性信号

基层医院实验室通常是购买成品的PCR试剂盒来检测HBVDNA含量，成品的PCR试剂盒往往是按照纯净的单一序列DNA经优化实验得到的，其特异性是由两段引物和一个探针（Taqman定量）共三段特异核酸序列保证的，而临床样本中成分非常复杂，由其提取的总核酸包罗各种序列的DNA或RNA，很容易出现非特异性假阳性信号，     

环介导等温扩增技术快速检测脑膜炎奈瑟菌属方法的建立

目的应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种快速敏感的脑膜炎奈瑟氏菌属检测方法。方法针对脑膜炎奈瑟菌属(ctrA)基因序列的6个区域设计4条LAMP引物(2条内引物、2条外引物),同时设计2条环引物,并对反应条件和反应体系进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性,并与普通PCR进行了比较。结果在适宜反应条件所设计引物对脑膜炎奈瑟菌的扩增的特异性及敏感性均较好,与普通PCR方法比较,LAMP敏感性比普通PCR高10倍。结论 LAMP检测速度相比PCR更快速,在60 min内即可完成扩增反应。实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测脑膜炎奈瑟氏菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用。     

急性淋巴系白血病微小残留病的动态监测

本研究旨在建立免疫球蛋白重链基因重排的实时定量PCR(RQ-PCR)检测方法,并探讨其在急性淋巴系白血病(ALL)微小残留病(MRD)动态监测中的应用价值。采用多重PCR筛选初诊ALL患者的IgH基因单克隆重排,PCR产物测序并进行序列比对,据其连接区序列设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)前向引物,联合下游保守JH引物和保守JH探针,用Taqman探针法RQ-PCR监测ALL患者治疗过程中各时间点的MRD水平,分析其敏感性和特异性。结果表明,在51例ALL患者中鉴定出21例单克隆IgH重排,其中有条件定量的为15例,标准曲线的斜率在-3.1～-3.9,相关系数均>0.98,敏感性在10-4-10-5,仅1例敏感性为10-3,定量范围多在10-4以下,背景的非特异性扩增均在低水平,不影响定量。7例MRD水平在10-3以下的患者一直持续缓解,8例MRD水平>10-3,复发率较高。结论:RQ-PCR方法定量IgH基因单克隆重排用于监测ALL患者的MRD水平,具有敏感性高、特异性强、定量结果可靠的优点。IgH重排水平与ALL患者预后高度相关。     

帕金森病患者载脂蛋白E基因多态性与痴呆相关性的分析

目的了解帕金森病痴呆(PDD)与载脂蛋白E(apoE)基因多态性的关系,探讨PDD的发病机制。方法应用PCR－RFLP技术检测11例PDD患者,40例帕金森病(PD)非痴呆患者和52例无关对照的apoE基因型。结果PDD组、PD非痴呆组和对照组在apoE等位基因频率及基因型分布上均无显著差异(P>0.05)。结论PDD的发病与apoE基因多态性无关,其发病的生物遗传学基础有别于Alzheimer病(AD)。     

用多聚酶链反应(PCR)快速诊断白色念珠菌感染

由白色念球菌引起的院内感染日益增多。应用多聚酶链反应(PCR)体外扩增白色念珠菌DNA.为临床敏感、特异、快速诊断白色念珠菌感染提供了有用的工具。本文就PCR检测白色念珠菌DNA的引物,标本处理,扩增程序,扩增产物分析以及临床应用效果予以介绍。