沉默HDAC6对嗜肺军团菌干扰RAW264.7自噬作用的影响

目的 以嗜肺军团菌感染HDAC6基因沉默的RAW264.7细胞为研究对象,检测自噬流及自噬相关因子表达水平的变化,探究HDAC6在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用机制。方法 利用RNAi技术介导基因沉默,构建shRNAHDAC6细胞,Western blot验证沉默效果。用嗜肺军团菌活菌和灭活菌[感染复数(MOI)=50]分别感染RAW264.7、sh-NC、shRNA-HDAC6细胞6、12、24 h。应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化;透射电镜观察嗜肺军团菌感染24 h后各组细胞内的自噬小体和自噬溶酶体;实时荧光定量PCR及Western blot法检测AMBRA1、ATG9B、P62、Beclin1、α-tubulin、LC3B的表达水平。结果 与RAW264.7对照组相比,shRNA-HDAC6细胞的HDAC6蛋白表达水平显著降低(P<0.05);自噬双标质粒检测自噬流结果显示,嗜肺军团菌活菌及灭活菌感染RAW264.7细胞,自噬流均减弱,沉默HDAC6后嗜肺军团菌感染巨噬细胞自噬流增加。透射电镜可观察到嗜肺军团菌感染巨噬...     

巨噬细胞Coronin-1的表达与非Mtb源性自噬相关性的实验研究

目的:研究巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬的相关性及其可能信号通路。方法:分别构建过表达Coronin-1的p EGFP-C1-Coronin-1质粒和干扰Coronin-1表达的p Genesil-1-Coronin-1质粒,通过G418加压筛选其RAW264.7细胞稳定转染株,即Coronin-1高表达细胞株(RAW264.7-Cor.Plus)和Coronin-1低表达细胞株(RAW264.7-Cor.Minus)。将RAW264.7-Cor.Plus组、RAW264.7组和RAW264.7-Cor.Minus组细胞分别采取完全培养基(空白处理对照)、饥饿、雷帕霉素、环孢素A等因素处理后,通过RT-PCR法检测Beclin-1的基因转录水平,Western blot法检测Coronin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ及Beclin-1的蛋白表达水平。结果:Coronin-1过表达质粒和siRNA质粒均构建成功,其细胞稳定筛选株具有过表达或抑制表达Coronin-1特性。1空白处理三组细胞,Western blot法检测LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;Western blot法检测Beclin-1:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;RTPCR法检测Beclin-1转录水平,趋势同Western blot;2饥饿处理三组细胞,LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;3雷帕霉素处理RAW264.7细胞,其Coronin-1蛋白被显著抑制;雷帕霉素和环孢素A分别处理RAW264.7-Cor.Plus细胞,其LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显较空白处理组高。结论:巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬具有相关性。在营养充足状态下,Coronin-1可抑制细胞自噬;在饥饿状态下,Coronin-1可促进细胞自噬。Coronin-1对自噬的调控可能与m TOR和钙离子信号通路有关。     

敲低Wnt7a抑制卡介苗诱导的小鼠肺泡上皮细胞自噬

目的 探究无翅基因7a(Wnt7a)对牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)感染的肺泡上皮细胞自噬水平的调控作用。方法使用干扰Wnt7a慢病毒及BCG单独作用或共处理TC-1小鼠肺泡上皮细胞，设置小干涉RNA对照(si-NC)组、 si-NC联合BCG组、 Wnt7a小干涉RNA(si-Wnt7a)组和si-Wnt7a联合BCG组。Western blot法检测Wnt7a、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62及自噬相关基因5(ATG5)蛋白表达水平，利用免疫荧光细胞化学染色检测LC3的分布以确定细胞自噬情况。结果 与si-NC组相比，BCG感染的TC-1细胞Wnt7a、 LC3和ATG5蛋白表达均升高、 LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著增加；与BCG组感染的TC-1细胞相比，si-Wnt7a联合BCG组Wnt7a、 LC3、 P62及ATG5蛋白表达均显著降低，LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著降低。结论 敲低Wnt7a抑制BCG诱导的肺泡上皮细胞自噬。     

卡介苗诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化与上调CD36表达有关

目的探讨卡介苗(BCG)感染对小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响以及引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的相关机制。方法培养RAW264.7巨噬细胞, 40μg/mL氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)预处理30 min,按BCG∶RAW264.7巨噬细胞=1∶1、 5∶1、 10∶1、 20∶1比例感染RAW264.7巨噬细胞24 h,油红O染色法检测不同感染比例的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响,以确定BCG感染诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的最适感染比例。接着分别用热灭活和未灭活的BCG以最适感染比例感染RAW264.7巨噬细胞,感染24h后分别对各组细胞进行油红O染色和提取RNA,探讨不同活力的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响和对RAW264.7巨噬细胞脂质摄入相关受体清道夫受体A1(SR-A1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、 CD36的mRNA表达水平的影响。结果不同感染比例的BCG均可诱导RAW264.7巨噬细胞发生泡沫样改变,其中以10∶1的感染比例最为明显。灭活BCG与未灭活BCG均引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化,其中未灭活的BCG感染组RAW264.7巨噬细胞泡沫化更为显著。与未感染组相比, BCG感染24 h后, CD36 mRNA的表达显著上调,且上调程度与RAW264.7巨噬细胞泡沫化程度相关。结论 BCG诱导巨噬细胞泡沫化形成可能与CD36的表达上调有关。     

RIP3对BCG感染后小鼠巨噬细胞凋亡的调控作用研究

目的:探讨受体相互作用蛋白3(RIP3)在卡介苗(BCG)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡过程中的调控作用。方法:构建RIP3腺病毒干扰载体并感染巨噬细胞,并用BCG进行感染。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;利用流式细胞术对细胞凋亡率、线粒体膜电位及活性氧含量进行检测;通过Western blot检测RIP3及凋亡相关蛋白的表达水平。结果:BCG感染RAW264.7细胞后,细胞活力下降且RIP3蛋白表达量显著上调(P0.01)。而与BCG单独感染组相比,BCG感染结合RIP3干扰处理组细胞凋亡率及活性氧含量降低,线粒体膜电位升高,同时促凋亡蛋白Bax与cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著降低(P0.01)。结论:在BCG感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的过程中,RIP3参与了BCG诱导的RAW264.7细胞的凋亡,且该过程可能是通过线粒体途径实现的。     

睾酮对结核分枝杆菌感染的RAW264.7细胞自噬的影响

目的探讨睾酮对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的鼠源巨噬细胞RAW264.7细胞自噬的影响及其分子机制。方法 MTB感染RAW264.7细胞24 h后,给予10~(-8)mol/L睾酮处理24 h;采用透射电镜观察细胞自噬情况,Western blot法检测细胞自噬相关蛋白以及MAPKs信号通路蛋白。结果睾酮干预MTB感染的RAW264.7细胞后自噬体、自噬特异标志物LC3Ⅱ均明显增加(P0.01),通路蛋白JNK磷酸化水平明显上调(P0.001)。结论睾酮可能通过激活JNK信号通路诱导MTB感染的RAW264.7细胞自噬。     

自噬抑制剂巴弗洛霉素A1对巨噬细胞极化的影响

目的:探讨自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf A1)对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7极化的影响。方法:用Baf A1作用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,酶联免疫吸附实验检测M1/M2极化相关细胞因子的含量;流式细胞术检测细胞表面M1/M2极化相关标志物;免疫荧光观察自噬小体形成情况;Western blot检测自噬相关蛋白水平变化。结果:Baf A1处理后,RAW264.7细胞分泌的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)显著增高(P0.01),而抑炎性细胞因子IL-10和IL-13的含量变化无显著差异。Baf A1处理的细胞表面标志物中CD197和HLA-DR(M1标志物)双阳性率与对照组相比显著升高(P0.05),说明Baf A1可以诱导巨噬细胞向M1方向极化。免疫荧光结果显示,Baf A1处理后细胞自噬小体显著增多(P0.05)。Western blot结果显示Baf A1处理后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达显著升高(P0.05),而P62蛋白表达无显著差异。在自噬激活剂雷帕霉素处理组中,自噬体同样显著增多(P0.05),但P62蛋白表达显著降低(P0.05)。结论:巴弗洛霉素A1可以诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7向M1方向极化,可能与其抑制自噬下游自噬溶酶体的形成有关。     

雷公藤甲素对TLR7激动剂Resiquimod诱导RAW264.7巨噬细胞自噬的影响

目的考察TLR7激动剂Resiquimod(R848)能否诱导RAW264.7细胞自噬以及雷公藤甲素对R848诱导的自噬的影响。方法用0.01、0.1、1μg/ml的TLR7激动剂R848诱导RAW264.7细胞12、24、36 h,Western blot检测自噬蛋白LC3II/I、P62、Beclin1和Atg5表达情况;RAW264.7细胞采用0.1μg/ml R848处理24 h诱导自噬后,给予5 ng/ml、10 ng/ml雷公藤甲素12、24 h对自噬相关蛋白LC3II/I、P62及通路蛋白AKT检测。结果 RAW264.7细胞采用0.1μg/ml R848处理24 h后自噬相关蛋白LC3II/I、P62、Beclin1和Atg5表达显著升高;加入不同质量浓度的TP后,LC3II/I、P62显著表达减少,通路蛋白AKT表达升高。结论TLR7激动剂R848能够诱导RAW264.7细胞自噬,而TP能够抑制R848诱导的自噬,并且该作用可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

miR-144通过靶向Atg4a调控卡介苗和雷帕霉素诱导的RAW264.7细胞自噬

目的研究卡介苗(BCG)对RAW264.7细胞中与细胞自噬相关的miRNA(miR-21、miR-181a、miR-155和miR-144)表达的影响,并以miR-144为研究对象,验证miR-144对自噬相关基因Atg4a的靶向调控关系,探究其在结核分枝杆菌感染宿主细胞过程中调控细胞自噬途径的作用机制。方法分别对RAW264.7巨噬细胞进行饥饿处理12 h、50 ng/m L雷帕霉素作用2 h、10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h;BCG刺激RAW264.7巨噬细胞12 h、24 h、48 h后,收集细胞,提取总RNA;利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21、miR-181a、miR-155及miR-144的表达水平;构建p MIR-Report-Atg4a及p MIR-ReportAtg4a mut重组质粒,利用双萤光素酶报告系统、qRT-PCR及Western blot法验证miR-144与Atg4a的靶向作用关系。结果 BCG刺激RAW264.7巨噬细胞后,可使miR-21、miR-155及miR-144表达上调,miR-181a表达下调;经雷帕霉素诱导的细胞自噬,4种miRNA表达量与正常组相比分别上调约64倍、52倍、14倍、1倍;与正常组相比,3-MA处理细胞组,miR-21、miR-144、miR-155、miR-181a的表达量分别下调1.22倍、1.05倍、1.54倍及12.5倍;双萤光素酶报告系统及Western blot法证实,miR-144可靶向作用于Atg4a-3'UTR并抑制其表达。结论 miR-144可靶向抑制自噬相关基因Atg4a的表达,参与调控RAW264.7巨噬细胞的自噬过程。     

维生素D诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用

目的:探讨维生素D诱导巨噬细胞产生自噬并清除巨噬细胞内结核分枝杆菌(Mtb)的作用。方法:使用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)诱导U937细胞分化使之具有吞噬能力,分化后的U937细胞随机分为阴性对照组、维生素D组、自噬抑制剂(3-MA)+维生素D组、阳性对照(雷帕霉素)组,以Mtb感染U937细胞6 h。感染后第4天,利用半定量RT-PCR检测自噬相关基因ATG5、Beclin-1及LL-37、LC3B mRNA的表达,流式细胞术检测LC3B-Ⅱ+和/或结核分枝杆菌抗原85A+(Ag85A+)的细胞。结果:与对照组相比,维生素D组ATG5、Beclin-1、LL-37、LC3B mRNA的表达增强(P<0.01),LC3B-Ⅱ+-细胞增多,Ag85A+-细胞减少,且LC3B-Ⅱ+-Ag85A--细胞增加(维生素D组38.0%比阴性对照组1.08%)。与维生素D组相比,在自噬抑制剂3-MA+维生素D组中,不但ATG5、Beclin-1、LC3B的mRNA表达受到抑制,LL-37的mRNA表达较维生素D组减少,而且3-MA抑制了细胞LC3B-Ⅱ的表达,同时抑制了1,25(OH)2D3对LC3B-Ⅱ+-Ag85A--细胞增加的作用。结论:维生素D能够诱导巨噬细胞产生自噬作用,并进一步有助于巨噬细胞清除结核分枝杆菌。     

酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶1对BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用

目的探讨酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶1(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 1,ACAT1)对卡介苗(BCG)感染巨噬细胞后胞内胆固醇水平及细胞自噬的调控作用。方法 BCG感染RAW264.7巨噬细胞不同时间后,采用qRT-PCR法检测ATAC1基因mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法检测ATAC1及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达水平,胆固醇定量检测试剂盒检测胞内胆固醇及胆固醇酯的变化,油红O染色法检测细胞内脂滴的含量,以感染0 h的细胞为对照组。结果在BCG感染巨噬细胞后,与对照组相比,ACAT1基因mRNA的表达在感染后2、6、12 h逐渐下降,12 h达到最低,差异极显著(P0.01);ACAT1蛋白的表达量随感染时间先降后升,在感染后12 h表达量最低,感染2 h、24 h与对照组相比差异显著(P0.05),感染6 h、12 h与对照组相比差异极显著(P0.01);胞内游离胆固醇含量在感染后2、6、12 h逐渐升高,与对照组相比差异极显著(P0.01);胆固醇酯含量逐渐下降,至12 h最低,6、12、24 h与对照组相比差异极显著(P0.01);胞内脂滴的数量随感染时间先降后升,且感染后12 h胞内脂滴数量最少。结论结核分枝杆菌感染巨噬细胞后,ACAT1表达下调,使胞内胆固醇酯合成量下降,胆固醇积累,激活细胞自噬。     

LRRK2/NF-κB信号对BCG诱导巨噬细胞RAW264.7炎症应答的调控

目的:探讨富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用机制。方法:用结核分枝杆菌疫苗株卡介苗(BCG)感染巨噬细胞RAW264.7,菌落形成单位(CFU)计数检测结核分枝杆菌生存率;酶联免疫吸附法测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6和干扰素γ(IFN-γ)表达水平;q PCR和Western blot法分别检测相关m RNA和蛋白的表达。结果:BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中LRRK2的m RNA和蛋白表达均显著上调,并刺激RAW264.7细胞释放大量细胞因子。此外,沉默LRRK2明显抑制BCG感染巨噬细胞的分枝杆菌存活率;同时,沉默LRRK2降低BCG刺激诱导分泌的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ。更为重要的是,LRRK2可能通过正调控NF-κB通路调节BCG诱导的炎症应答进程。结论:LRRK2/NF-κB信号正调控BCG刺激诱导的巨噬细胞炎症应答进程。本研究结果为结核病在基因水平上的诊断和治疗提供了实验依据。     

髓样细胞表达的触发受体1抑制LPS应激下巨噬细胞的自噬

目的　观察髓样细胞表达的触发受体1（TREM-1）对脂多糖（LPS）应激下巨噬细胞自噬相关基因表达的影响。 方法　观察LPS应激下的巨噬细胞TREM-1蛋白的表达。分别选用TREM-1的激动剂（MAB1187）和TREM-1的拮抗剂（LR12）作用于巨噬细胞,利用qPCR检测巨噬细胞自噬相关基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）mRNA的表达;采用Western Blot检测巨噬细胞TREM-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达;采用免疫荧光检测在LPS应激与TREM-1激活的情况下,巨噬细胞的自噬标志蛋白LC3表达。 结果　LPS（400 ng/mL、1000 ng/mL）应激下巨噬细胞TREM-1蛋白表达明显增加;LPS（1000 ng/mL）作用巨噬细胞24 h,巨噬细胞TREM-1蛋白表达达到峰值。LPS应激的巨噬细胞自噬基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志分子LC3 mRNA表达均降低;当给予TREM-1拮抗剂后,巨噬细胞的ATG7、ATG5、ATG12、LC3 mRNA表达均升高,而采用TREM-1激动剂后,自噬基因表达被抑制。Western Blot检测结果显示,TREM-1可抑制LPS应激下巨噬细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达。免疫荧光检测表明TREM-1激动剂可使巨噬细胞胞内的LC3蛋白表达量减少。 结论　巨噬细胞胞膜上TREM-1激活后,可使巨噬细胞自噬减弱,提示LPS应激下的巨噬细胞TREM-1可能通过抑制巨噬细胞的正常自噬从而发挥炎症放大作用。     

miR-142-3p 靶向ATG4c 调控RAW264.7 巨噬细胞自噬

目的:研究miR-142-3p 对自噬相关基因ATG4c 的靶向调控作用,探究miR-142-3p 影响RAW264.7 细胞自噬途径的作用机制。方法:生物信息学软件分析miR-142-3p 的靶基因为ATG4c,构建pMIR-Report-ATG4c 和pMIR-Report-ATG4c mut 重组质粒,双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 与ATG4c 的靶向作用;将做不同处理的RAW264.7 细胞分为4 组:正常细胞作为对照、50 ng/ ml 雷帕霉素作用2 h、EBSS 饥饿作用12 h、10 nmol/ L 的3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h 后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-142-3p 不同干预组中的相对表达情况;将miR-142-3p mimics、miR- 142-3p inhibitor 及miR-142-3p control 分别转染到RAW264.7 细胞中,检测miR-142-3p 和LC3域的相对表达。结果:双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 通过靶向作用于ATG4c 的3忆-UTR 抑制其表达;与对照组相比,雷帕霉素和饥饿处理的RAW264.7 细胞miR-142-3p 明显上调,而3-MA 处理组miR-142-3p 明显下调;与miR-142-3p control 组相比,转染miR-142-3p mimics 组中LC3域蛋白表达显著下调,而miR-142-3p inhibitor 组中表达显著上调。结论:miR-142-3p 通过靶向调控自噬相关基因ATG4c,参与RAW264.7 小鼠巨噬细胞自噬的调控。     

烟曲霉感染时NADPH氧化酶通过诱导活性氧活化巨噬细胞自噬

目的研究NADPH氧化酶(NOX)参与烟曲霉孢子诱导巨噬细胞自噬及其作用机制。方法取对数生长期的RAW264.7细胞,随机分为3组:以烟曲霉孢子刺激的处理组、烟曲霉孢子联合NOX抑制剂氯化二亚苯基碘鎓(DPI)的处理组和无处理的空白组。细胞作用2 h后荧光显微镜观察细胞内二氯荧光黄亮度以检测活性氧(ROS)水平,免疫印迹法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达量,免疫荧光技术观察LC3的表达与定位。结果烟曲霉孢子刺激后RAW264.7细胞的ROS与LC3BⅡ表达水平显著升高,同时LC3呈斑点状聚集并与烟曲霉孢子共定位;以DPI抑制后ROS与LC3 BⅡ表达量与空白组相比无明显变化,并且LC3在细胞内弥散分布。结论烟曲霉感染时NOX通过产生ROS活化巨噬细胞自噬。     

ATG5敲低后抑制人肺癌细胞H1299自噬并增强南蛇藤素诱导的细胞凋亡

目的构建自噬相关基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)低表达肺癌细胞株,观察肺癌细胞自噬活性,检测南蛇藤素对肺癌细胞凋亡的影响。方法用ATG5 shRNA技术构建ATG5敲低的人肺癌H1299细胞株作为ATG5敲低组,未敲低ATG5的H1299细胞作为对照组;荧光定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中ATG5的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)及死骨片蛋白1的(sequestosome 1,P62)表达,并转染红色荧光标记的LC3质粒观察LC3斑点聚集情况;经南蛇藤素刺激后,以流式细胞术检测细胞凋亡,最后使用Western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax等蛋白的表达。结果慢病毒感染组ATG5较对照组mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05);ATG5敲低后LC3-Ⅱ水平下降,P62水平上升,并且转染后RFP-LC3斑点聚集减少(P0.05)。相比对照组,南蛇藤素明显促进ATG5敲低细胞凋亡(P0.01);ATG5敲低组中促凋亡分子Bax、cleaved caspase-3表达比对照组明显增加(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P0.05)。结论 ATG5敲低抑制肺癌细胞自噬后,南蛇藤素能够明显增强人肺癌细胞的凋亡,提示抑制肺癌细胞自噬可能为针对性处理肺癌细胞耐药提供新的思路。     

雷帕霉素对RAW264.7细胞6种miRNAs表达的影响及miR-20a对ATG16L1的靶向调控作用

目的:探讨雷帕霉素对miR-17-92簇中的6种miRNAs表达的影响,及miR-20a对ATG16L1基因的靶向调控作用。方法:利用qRT-PCR检测雷帕霉素对RAW264.7细胞miR-17-92簇中的miR-20a等6种miRNAs的表达水平;通过双荧光素酶报告系统、Western blot,验证miR-20a对ATG16L1的靶向调控关系。结果:与正常组相比,雷帕霉素组RAW264.7细胞的miR-17、miR-18a、miR-20a表达水平显著上调(P0.05);3-MA组RAW264.7细胞的miR-20a表达水平显著下调(P0.05)。双荧光素酶报告系统结果显示,miR-20a可靶向ATG16L1-3'-UTR,抑制其表达;Western blot结果显示,miR-20a能明显抑制ATG16L1蛋白的表达,说明miR-20a可靶向抑制ATG16L1的表达,参与调控细胞自噬过程。结论:miR-20可靶向抑制Atg16L1的表达,参与调控RAW264.7细胞自噬过程。     

嗜肺军团菌激活Nrf2-Keap1通路抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞自噬

目的观察嗜肺军团菌(LP)对RAW264.7巨噬细胞自噬流及其自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制。方法活的LP和灭活的LP[感染复数(MOI)=10, 50, 100]分别处理RAW264.7巨噬细胞1、 2、 3 h,通过筛选得出MOI=50,处理2 h为其最佳作用条件。用雷帕霉素(RAPA)处理RAW264.7巨噬细胞12 h后,再加入活的和灭活的LP共培养2 h,并设正常对照组、 RAPA处理组、活LP组、 RAPA处理的活LP组、灭活LP组和RAPA处理的灭活LP组。用携带双荧光标记蛋白基因和微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)基因的真核过表达质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B转染巨噬细胞,监测巨噬细胞自噬流的变化;用基因芯片在处理的最佳时间点筛选出LP影响巨噬细胞自噬的相关因子溶酶体/内体膜跨膜蛋白封闭蛋白(CLN3)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、 G蛋白信号传导调节蛋白19(RGS19)、肿瘤坏死因子(TNF)、组织蛋白酶B (CTSB)、 GABA A型受体相关蛋白类似物2(GABARAPL2)、 P62、微管相关蛋白1轻链3(LC3);实时荧光定量PCR验证基因芯片结果并检测相关信号通路因子核因子E2相关因子2(Nrf2)、 beclin1和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)的mRNA水平; Western blot法验证基因芯片结果并检测Nrf2、 beclin1和Keap1的蛋白水平。结果与对照组相比,活LP组和灭活LP组的自噬流受到抑制;与RAPA处理组相比,活LP组和灭活LP组自噬流受到抑制。基因芯片检测显示活LP组和灭活LP组LC3的表达下调, P62的表达上调。实时定量PCR、 Western blot验证结果与基因芯片一致。Keap1、 beclin1的mRNA和蛋白水平明显下降, Nrf2 mRNA和蛋白的水平明显增加。结论 LP可抑制巨噬细胞自噬,可能与激活Nrf2-Keap1信号通路有关。     

LXR-ABCA1/ABCG1通路对BCG感染的巨噬细胞凋亡和炎性反应的调控作用

目的 揭示LXR-ABCA1/ABCG1通路对BCG感染后巨噬细胞凋亡和炎性反应的调控作用。方法 采用T0901317预处理RAW264.7巨噬细胞2 h和BCG感染24 h,设置4个实验组：对照组、T0901317组、BCG感染组和T0901317+BCG感染组。采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9和TLR信号通路相关蛋白TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κB p65、IRF3、TBK1的表达,采用ELISA方法检测细胞培养上清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。结果 与对照组比较,BCG感染组凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9及依赖MyD88途径蛋白TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κBp65的表达均上调（P<0.01）,促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平上升（P<0.01）;与BCG感染组相比,T09013...     

稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株的建立

目的建立能够稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(RFP-GFP-LC3)的小鼠RAW264.7巨噬细胞。方法构建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重组质粒载体,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒上清后感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,用荧光显微镜和流式细胞术分析感染效率。饥饿处理稳定感染细胞,荧光显微镜下观察RFP-GFP-LC3斑点。结果成功构建了慢病毒p LV-CMV-RFPGFP-LC3,经感染和嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7细胞;荧光显微镜和流式细胞术显示RFP和GFP荧光率均达到100%,饥饿处理后自噬斑点显著增多。结论成功建立稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,为自噬研究建立了可靠细胞平台。