临床研究3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV) DNA的灵敏度和特异度,初步探讨其用于HBV DNA检测的临床价值.方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎患者及30例阴性参比血清标本中的HBV DNA,以荧光定量PCR结果为标准,比较3种试剂检测灵敏度和特异度.结果 3种试剂盒的HBV DNA阳性检出率分别为93.3%(28/30)、96.7%(29/30)、100%(30/30);3种试剂检测HBV阴性的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/mL,B、C公司均为102 IU/mL.结论 使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV DNA快速检测.     

隐匿性乙型肝炎病毒感染者血清HBsAg阴性原因探讨

目的：探讨隐匿性乙型肝炎病毒（HBV）感染者血清HBsAg阴性的原因。方法：用高灵敏的电化学发光免疫技术对61例隐匿性HBV感染者血清HBsAg进行定量测定,同时用荧光定量PCR对血清HBV—DNA进行定量检测。结果：61例隐匿性乙型肝炎病毒感染中,血清HBsAg未检出有8例,在0．05ng／ml-0．1ng／ml有27例,0．1ng／ml-0．5ng／ml有21例,0．5ng／ml～10ng／ml有5例。隐匿性HBV感染者血清HBVDNA水平大多数低于103copies／ml。结论：隐匿性HBV感染者血清HBsAg阴性的原因主要是HBV复制和基因表达的严重抑制。     

HBV DNA荧光定量PCR与乙型肝炎病毒血清标志物检测的相关性探讨

目的探讨鞍山地区HBV DNA荧光定量PCR与乙型肝炎病毒血清标志物检测的相关性。方法用深圳匹基生物工程股份有限公司生产的HBVDNA荧光定量PCR检测试剂。结果乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒核心抗体(抗-HB)三项均阳性，患者血清标本中检出HBV DNA阳性率高达98．4％；HBsAg、乙型肝炎病毒e抗体(抗-HBe)、乙型肝炎病毒核心抗体(抗-HBc)三项均阳性，患者血清标本中检出HBV DNA阳性率达63．1％。结论HBV DNA荧光定量PCR检测在临床上对乙型肝炎基因诊断，特别是进行抗病毒治疗和治疗监测方面具有重要意义。     

实时FQ-PCR与时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎分析

目的：探讨实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）定量检测乙型肝炎病毒（HBV—DNA）与时间分辨荧光免疫分析法对乙型肝炎免疫标志物（HBV—M）检测对乙型肝炎实验室诊断的敏感性。方法：采用两种方法分别对800例本院传染科住院及门诊可疑病人血清标本进行检测。结果：用FQ—PCR检测800例。HBV—DNA阳性例数602,阳性率87．81％,用时间分辨荧光免疫分析法检测800例,HBV—M的阳性例数477,阳性率59．63％,通过χ^2检检,χ^2=2．98,P〈0．05。结论：在乙型肝炎的实验室诊断中,FQ—PCR检测乙型肝炎病毒HBV—DNA更优于时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎免疫标志物HBV—M。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒-DNA的临床意义

目的　评价荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测乙型肝炎病毒 (HBV) DNA对辨别病毒复制的临床意义。　方法　采用荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验 (ELISA)方法 ,检测 79份血清HBV DNA拷贝数和免疫学血清指标。　结果　在乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒核心抗体 (抗 HBc)阳性的 2 6份标本中 ,HBV DNA全部阳性 ,平均拷贝数为2 7× 10 5/ml。 8例HBsAg、HBeAg阳性的标本中 ,HBV DNA全部阳性 ,平均拷贝数为 5 2× 10 4/ml。 2 1例HBsAg、乙型肝炎病毒e抗体 (抗 HBe)、抗 HBc阳性的标本中 ,HBV DNA阳性率为 6 6 7% ,平均拷贝数为 3 1× 10 4/ml。 9例HBsAg阳性的标本中HBV DNA阳性率为 11% ,平均拷贝数为 1 4× 10 3 /ml。　结论　荧光定量聚合酶链反应检测HBV DNA可以更加准确地判断HBV的感染和复制情况。     

标本因素对荧光定量PCR检测HBV DNA的影响

目的: 探讨标本溶血、黄疸、脂血对荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的影响。方法: 荧光定量PCR检测无溶血、无黄疸、非脂血血清和溶血、黄疸、高脂血清标本的HBV DNA。结果: 溶血、黄疸、高脂血血清与无溶血、无黄疸、非脂血血清HBV DNA定量检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论: 标本溶血、黄疸、脂血对荧光定量PCR检测HBV DNA无干扰。     

高效抗逆转录病毒治疗的HIV/HBV重叠感染者耐药HBV毒株C区和P区基因序列分析

目的：进一步研究乙肝病毒(HBV)耐高效抗逆转录疗法(HAART)的耐药机制。方法：用HBV—DNA荧光定量试剂盒，定量检测36例HAART治疗的HIV／HBV重叠感染者中HBV—DNA，用HBV—DNAC区和P区引物常规扩增HBV—DNAC区和P区产物，PCR产物纯化后测序，用BLAST软件分析序列，与国际HBV基因库对比。结果：36例HAART治疗的HIV／HBV重叠感染者中，HBV—DNA阳性4例(11．1％)，血清中HBV—DNA拷贝数3例在10^4copies／ml级，1例在10^7copies／ml级。对1例HBV—DNA在10^7copies／ml级标本进行HBVDNAC区和P区序列测定，用BLAST软件与国际基因库对比，结果，C区nt2412位T→C，nt2413位T→C，P区nt741位A→G(YMDD→YVDD)。结论：HAART治疗的HIV／HBV重叠感染者，HBV耐药可能与HBV—DNAC区和P区联合变异有关。     

120例乙型肝炎病毒血清标志物与HBV—DNA的检测分析

目的：探讨120例乙型肝炎病毒血清标志物与HBV—DNA检测分析的相关性。方法：我院接收120例乙型肝炎患者,将其分为A、B、C3组,A组49例为大三阳患者,B组42例为小三阳患者,C组29例为HBsAg、抗一HBc阳性患者,采用荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）进行HBV—DNA的含量测定,使用酶联免疫吸附法（ELISA）检测乙型肝炎病毒血清标志物,两种方法进行同步检测。结果：经过HBV—DNA测定后,A组的阳性率为97．96％,B组的阳性率为61．90,C组的阳性率为34．48％。A组与B组和C组相比较,差异显著,P〈0．05,具有统计学意义。结论：乙型肝炎病毒血清标志物与HBV—DNA均有一定的联系,采用HBV—DNA含量测定有利于疗效观察和预后判断,在临床诊断方面提供可靠的依据,该方法值得在临床上推广使用。     

乙型肝炎病毒大蛋白含量与病毒复制的关系

目的 通过定量测定乙型肝炎病毒（HBV）感染者血清中HBV大蛋白(HBV-LHBS)的含量,探讨其与HBV病毒复制的关系。 方法 以荧光定量PCR检测175份HBV病毒感染者血清HBV-DNA,将这些标本按DNA拷贝数分为3组,以酶联免疫吸附分析(ELISA)检测HBV-LHBS和PreS1抗原。结果 ≥106 copies/ml组,LHBS阳性率和定量检测结果分别为98.4℅和(94.74±31.50) ng/ml,103～105 copies/ml组,LHBS阳性率和定量检测结果为75.8℅和(30.47±21.33) ng/ml, ≤103copies/ml组,LHBS阳性率和定量检测结果为33.3℅和(14.84±10.36) ng/ml, 3组标本PreS1抗原阳性率依次为87.1℅﹑43.5℅﹑17.6℅;HBeAg阳性组血清中LHBS阳性率为83.7℅,PreS1抗原阳性率为68.2℅;HBeAg阴性血清中LHBS阳性率为53.5℅,PreS1抗原阳性率为36.6℅。结论 LHBS能较好地反映HBV感染者体内病毒的复制程度,而且其定量结果与HBV DNA呈现良好的相关性,因此LHBS定量检测可能成为较好判断HBV活动的新的血清学指标。 【关键词】乙肝病毒大蛋白HBV-LHBS 乙型肝炎病毒HBV HBV DNA     

荧光定量聚合酶链反应与分支链DNA信号扩增法检测血清HBV DNA的比较

目的了解荧光定量聚合酶链反应(PCR)法与分支链DNA信号扩增(bDNA)法在检测血清中HBV DNA含量上的优缺点.方法分别用这两种方法平行检测44份乙型肝炎患者的血清标本,并与定性PCR检测结果比较.同时用荧光定量PCR法观察15例乙肝患者干扰素治疗期间HBV DNA含量变化.结果①荧光定量PCR法和bDNA法比较,a前者测出的HBV DNA含量均值为(3.50×105±33.6)copies/μl;后者为(3.07×105±12.9)copies/μl,两者比较差异无显著性(P＞0.05).b前者的HBV DNA阳性率79.5%;后者及常规PCR定性法均为59.1%.荧光定量PCR法的阳性检出率显著高于bDNA法及常规定性PCR法(P＜0.05).②15例中5例获完全应答的乙型肝炎患者其血清HBV DNA含量在治疗16周内均逐渐下降至完全转阴.结论荧光定量PCR法与bDNA法在检测血清HBV DNA含量上,结果大多一致,且敏感性强,检验也较简便、价廉,并能较好评价和检测乙肝患者抗病毒疗效,宜于临床推广.     

HBV变异对乙肝病毒标志物和DNA定量的影响

目的：了解无锡地区HBV前C／C基因变异情况,探讨基因变异对乙肝病毒标志物（HBVM）及HBV DNA定量的影响。方法：HBVM用时间分辨荧光定量试剂检测;HBV DNA定量PCR以德国Roche Lightcycler荧光定量扩增仪检测;HBV DNA前C／C测序使用①德国Roche Mag NA Pure LC全自动核酸提取,加样系统;②美国Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。结果：92例乙肝患者血清中有41例（44．6％）发生前C／C区nt1896位变异,41例中有34例HbeAg阴性,7例HbeAg仍为阳性;以nt1896位是否变异分组,变异组和未变异组HBV DNA定量无显著性差异。结论：nt1896位变异导致HBeAg转阴,HBV病毒变异对HBVM有决定性的影响,但该变异对HBV复制无影响。     

3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙肝患者血清中HBV的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙肝患者血清中HBV的灵敏度和特异性,初步探讨其用于乙肝病毒检测的临床价值。 方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎病人及30例阴性参比血清标本中的HBV,以荧光定量PCR结果为标准,比较三种试剂检测灵敏度和特异性。结果 3种试剂盒的HBV检出率分别为93.3%（28/30）、96.7%（29/30）、100%（30/30）;3种试剂检测HBV的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/ml,B、C公司均为102 IU/ml。结论 本研究使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV快速检测。     

血清乙肝病毒DNA的快速提取及定量 PCR测定中应用的探讨

目的寻找简单、快速地提取血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA并能应用于定量PCP,测定的方法.方法使用碱裂解法、酚氯仿法和煮沸裂解法同时提取血清HBV DNA,比较荧光定量PCP测定的重复性和测定值的差异.结果碱裂解法所得HBV DNA量高于酚氯仿法和煮沸裂解法(P＜0.05),并且碱裂解法所得结果的重复性好于酚氯仿法和煮沸裂解法(CV分别为0.21,0.28和0.33).结论碱裂解法提取HBV DNA简单、快速,适用于HBV DNA荧光定量测定.     

乙型肝炎病毒DNA定量分析的临床意义

目的:探讨乙型肝炎病毒HBV DNA含量与血清标记物的相关性及其对乙型肝炎诊断、预后的意义。方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测1652例乙肝患者血清学标记物(HBV—M),其血清学模型包括以下9种组合;并选取160例HBV M全阴性正常人作为对照。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血清中HBV DNA含量。结果:1、2组HBV DNA阳性率为98.4%和96.67%,明显高于其它组。结论:HBV DNA含量与乙肝病毒e抗原具有显著相关性,HBV M和HBV DNA定量检测对于临床乙肝病毒感染、复制及临床治疗有重要意义。     

新型HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒的应用

目的:观察新型HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒的临床应用价值。方法:采用荧光定量PCR检测法,用10份正常血清、10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证该试剂盒检测结果的重复性、特异性和灵敏度;并将该10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清结果与同时用传统方法所测结果进行配对检验。结果:10份正常血清标本均无假阳性HBV-DNA检测结果,特异性极好;灵敏度可达到103 IU/ml,重复性和准确性两者之间差异无显著性(t=1.15,P>0.05)。结论:该方法特异性和灵敏度高,方便、快捷,可替代传统试剂盒用于HBV的临床检测和科学研究。     

LightCycler实时监测PCR定量分析血清HBV DNA

目的 检验LightCycler实时监测PCR（real-time detection PCR,RTD-PCR)对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性和可重复性，探讨HBV血清标志物与HBV DNA定量的关系。方法 HBV定量按深圳匹基公司乙肝PCR荧光检测试剂盒使用说明，对乙肝标志物已明确的773例血清中HBV DNA定量结果进行统计分析。结果 实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性高，可检测低至1000拷贝／ml血清；可重复性好，批间误差＜20％；各种标志物类型的血清HBV DNA含量分布情况表明，HBV血清标志物中HBeAg与HBV DNA含量有明显的关系，一般HBeAg阳性血清HBV DNA含量较高，但也有相当一部分例外。结论 LightCycler实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测灵敏性高可重复性好；仅根据HBV血清标志物往往不能确定乙肝患者HBV DNA复制水平的高低，HBV DNA定量检测具有十分重要的临床意义。     

吉林市1200例乙肝患者DNA含量检测与免疫学标志物分析

目的探讨乙肝病毒DNA含量与乙肝病毒感染免疫学标志物常见模式之间的关系。方法应用荧光定量PCR法对吉林市1200例乙型肝炎患者及200例健康对照者的血清进行HBVDNA含量检测,并用ELISA法进行乙型肝炎病毒免疫学标志物检测。结果各组之间DNA含量有差异（P〈0.001）。大三阳组患者血清HBVDNA含量阳性检出率明显高于除HBsAg（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb-IgM（＋）组以外的其他各组（P〈0.001）。HBeAg阳性和HBVDNA阳性有较高的一致性（P〈0.001）。结论吉林市1200例乙型肝炎患者各模式分组中大三阳组患者血清HBVDNA含量阳性检出率及HBVDNA的平均含量最高,HBeAg检测和DNA定量检测阳性率具有较高一致性。     

乙型肝炎患者治疗后血清中e抗原与病毒DNA水平的关系

目的 通过对乙型肝炎病毒血清学标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBcIgG)的检测及内标、外标两种聚合酶链反应(PCR)方法 检测乙型肝炎病毒载量的比对,更好地了解人体内乙型肝炎病毒携带情况,指导临床诊治.方法对经治疗后丙氨酸氨基转移酶(ALT)/天冬氨酸氨基转移酶(AST)正常、COBAS AMPLICOR定量PCR(内标法)检测不到乙肝病毒DNA(HBV-DNA)、用Abbott AxSYM微粒子酶免分析法(MEIA)检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性、表面抗体(抗-HBs)阴性、e抗原(HBeAg)阳性(HBeAg＞4 S/CO)、抗-HBe阴性、抗-HBcIgG阳性的42例血清,再用上海复星长征医学科学有限公司提供的HBV-PCR外标法荧光定量检测试剂盒,Light Cycler实时荧光定量PCR仪检测.结果 42例ALT/AST正常,HBeAg阳性(HBeAg＞4 S/CO以上),HBeAg的平均值42.26 S/CO.COBAS AMPLICOR定量PCR(内标法)未检测到HBV-DNA(＜300拷贝/ml)的血清;用Light Cycler定量PCR仪(外标法)检测HBV-DNA,有7例为阳性,7例HBV-DNA的平均含量3.1×105拷贝/ml,,阳性率17%.结论 乙型肝炎病毒e抗原阳性并不说明体内病毒复制一定活跃.经治疗后,病毒复制下降,部分患者e抗原仍阳性,e抗原何时消失有待进一步研究.血清学标志与HBV复制状态存在不一致性,兼顾内、外标两种PCR方法检测HBV-DNA更客观.     

乙型肝炎患者血清中分泌型IgA水平与HBV DNA含量的关系

湖北省鹤峰县人民医院检验科,鹤峰 445800目的 研究乙型肝炎患者血清中分泌型IgA(SIgA)水平与乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量的关系,为临床提供一个新的评价HBV复制状态及肝细胞损伤的指标。方法 100份经ELISA检测并确诊为乙型肝炎的患者血清用荧光定量PCR检测HBV DNA的拷贝数,用ELISA并经酶标仪定量其SIgA的量。结果 SIgA的含量与HBVDNA的拷贝数的对数呈正相关(r=0.69,P<0.01),在HBsAg( )/HBeAg( )/HBcAb( )组和HBsAg( )/HBeAb( )/HBcAb( )组中SIgA含量差异无显著性意义(P>0.05),而HBV DNA拷贝数前者明显高于后者(P<0.01)。结论 乙型肝炎患者血清SIgA的含量在评价HBV的传染性及肝细胞损伤程度方面比乙型肝炎血清学标志物(HBV-M)更灵敏、准确。     

Nested real-time quantitative polymerase chain reaction assay

Background  Successful treatment of hepatitis B can be achieved only if the template for hepatitis B virus (HBV) DNA replication, the covalently closed circular HBV DNA (cccDNA) can be completely cleared. To date, detecting cccDNA remains clinically challenging. The purpose of this study was to develop a nested real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) assay for detecting HBV cccDNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and bone marrow mononuclear cells (MMNCs).

Methods  Based on the structural differences between HBV cccDNA and HBV relaxed circular DNA (rcDNA), two pairs of primers were synthesized as well as a downstream TaqMan probe. Blood and bone marrow samples were collected from hepatitis B patients and healthy controls. To remove rcDNA, samples were incubated with mung bean nuclease and the resultant purified HBV cccDNA was then amplified by nested real-time fluorescence quantitative PCR. The cccDNA levels were calculated using a positive standard.

Results  The nested real-time fluorescence quantitative PCR method for HBV cccDNA was successful, with a linear range of 3.0×10² copies/ml to 3.9×l0⁸ copies/ml. Of the 25 PBMC samples and 7 MMNC samples obtained from chronic hepatitis B or liver cirrhosis patients, 3 MMNC samples and 9 PBMC samples were positive for HBV cccDNA, while all of the 21 PBMC samples from healthy controls were negative.

Conclusion  The nested real-time fluorescence quantitative PCR may be used as an important tool for detecting cccDNA in hepatitis B patients.