稳定表达淋巴细胞趋化因子的大鼠系膜细胞载体的构建

目的 探讨以肾小球系膜细胞作为高表达大鼠淋巴细胞趋化因子(Lm)的载体的可行性，从而为深入研究淋巴细胞趋化因子的作用和体内活性创造条件。方法 采用RT-PCR法获得大鼠的Ltn的编码区全长的cDNA序列；应用基因重组技术和限制性内切酶酶切法构建并鉴定pcDNA3．1／Lm真核表达载体；用LipofectAMINEPUUS脂质体转染法将构建的质粒及空质粒瞬时转染于SKOV3细胞；用RT—PCR和ELISA法检测Ltn mRNA及蛋白质水平的表达，进而用pcDNA3．1／LacZ和pcDNA3．1／Ltn稳定转染原代培养的WKY大鼠肾小球系膜细胞，用潮霉素B筛选获得稳定表达报告基因LacZ和大鼠Ltn的细胞克隆。结果 测序结果显示质粒载体中正确地插入了大鼠Lm的编码基因；RT-PCR显示在瞬时转染的SKOV3细胞和稳定转染的4个系膜细胞克隆中Ltn mRNA表达增高；ELISA证实细胞培养上清中Ltn的蛋白质浓度较对照组明显升高。此外，X-gal染色显示获得了2个稳定表达β-半乳糖苷酶基因的系膜细胞克隆。结论 本研究成功地构建了真核表达质粒载体pcDNA3．1／hygro／Ltn，获得了稳定表达大鼠Lm的肾小球系膜细胞克隆，并在mRNA及蛋白质水平上证实了Lm的表达，为进一步研究Lm的体内活性奠定了基础。     

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的：构建PIAS3 （活化型STAT3抑制蛋白）的Myc融合蛋白真核表达重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法： 采用PCR方法，扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上，将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果：重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4 357和1 318 bp 2条带，XbaⅠ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带，与预期结果一致。测序结果显示，13个氨基酸Myc在N端，然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达，在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带。结论：成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。     

人疱疹病毒6型101K被膜蛋白主要抗原决定簇区原核表达克隆的构建和表达

目的构建人疱疹病毒6型(HHV-6)101K被膜蛋白的原核高效表达克隆,并进行原核表达。方法PCR扩增HHV-6B 101K被膜蛋白的主要抗原决定簇区(666~834aa)编码基因片段(nt2 347~2 853),并导入T载体进行测序,与GenBank中HHV-6标准毒株序列比较以进一步鉴定。目的基因及表达载体pThioHis A分别经双酶切后连接,转化宿主菌E.coli BL21,应用PCR法及限制性核酸内切酶双重鉴定原核表达质粒,并经测序证实。IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白。结果PCR获得的目的基因序列与GenBank中HHV-6B标准毒株Z29序列一致,重组质粒诱导菌表达产物出现相对分子质量为31 900的融合蛋白条带。结论HHV-6 101K蛋白的原核表达克隆构建和表达成功,为进一步完善HHV-6活动性感染的血清学诊断提供了实验基础。     

Lac启动子在可溶性抗体Fab表达中的作用

目的 :探讨Lac启动子在可溶性抗体Fab表达中的作用。方法 :利用DNA重组的方法对P3 -3G9噬菌体抗体表达载体[1 ] 进行改建 ,通过免疫印迹试验鉴定新的载体P3G9-L是否有可溶性Fab的表达。结果 :1.P3G9-L为单Lac启动子同时驱动Fd段及K链的双顺反子的可溶性Fab段表达载体。 2 .P3G9-L中的Lac启动子的作用是缓和的 ,可溶性Fab表达量较低。结论 :1 Lac启动于可以用于可溶性抗体Fab的表达体系。 2 双Lac启动子完全可由单Lac启动子取代     

Rb及P~(16)蛋白表达与皮肤癌相关性研究

目的 :分析 Rb及 P1 6 蛋白与皮肤癌的关系 ,探讨二者表达的相关性。方法 :应用免疫组化 SP法检测皮肤癌蜡块标本中Rb及 P1 6 蛋白的表达。结果 :Rb及 P1 6 表达强度在皮肤癌 、 级差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,在皮肤癌 、 级差异无显著性 (P>0 .0 5 )。 ～ 级与 ～ 级差异显著 (P<0 .0 5 )。Rb蛋白与 P1 6蛋白表达呈负相关。结论 :Rb蛋白表达与 P1 6蛋白表达缺失在皮肤癌发生中起作用。 Rb与 P1 6蛋白表达相互抑制 ,是皮肤癌的特征之一。     

帕金森病患者血清中M/Z2260肽的表达与鉴定

目的探讨帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者血清蛋白质生物标志物。方法选择原发性PD患者和正常人血清为样本,用弱阳离子交换(weak cationic exchange,WCX)磁珠捕获血清蛋白质组分,用基质辅助的激光解析离子化飞行时间质谱仪(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight masss pectrometer,MALDI-TOF-MS)检测各捕获组分的蛋白质质谱,用统计学方法分析原发性PD患者和健康人的蛋白质谱,筛选差异分子,用LC-MALDI-TOF/TOF鉴定差异分子,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定差异表达分子含量。结果在相对分子质量1000～50000范围内共检测到107个蛋白峰,其中9个蛋白质的表达发生显著变化(P<0.01)。一个相对分子质量为2260.1的蛋白质在PD血清中显著升高,是血清富组氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein,HRG)的C端降解产物。ELISA方法测定结果显示PD患者血清HRG含量低于正常人(P<0.05)。结论 PD患者血清低相对分子质量蛋白质的表达与正常人差异有统计学意义。HRG在PD患者血清中的含量低于正常人,而其C端降解片段在PD患者血清中的表达显著高于正常人。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的 :构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法 :设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到EndostatincDNA ,并在 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ,经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(- )中。将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后用G4 18筛选获得克隆 ,采用RT PCR和West ern blot检测Endostatin的表达。结果 :测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确 ,并且在其 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ;RT PCR显示转染后的HT10 80细胞可以有效地转录EndostatinmRNA ;Western blot检测到转染后的HT10 80细胞上清有相应的蛋白质 ,大小为 2 0kD左右。结论 :含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外 ,本研究为Endostatin的功能研究及应用于基因治疗提供基础     

胶质细胞源性神经营养因子在链霉菌的分泌表达

目的：构建胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达质粒，实现GDNF在链霉菌的分泌表达。方法：从人基因组中克隆GDNF成熟肽编码基因，与链霉菌酪蛋白酶melC1启动子和信号肽DNA序列融合。melC1信号肽DNA与GDNF融合后地翻译框呆的漂移，且GDNF的转录受控于melC1启动子。融合基因与链霉菌载体pIJ702连接并转化Slividans TK24原生质体。结果：经抗性筛选及限制性酶切分析获得重组质粒pIJMC。携带pIJMG的链霉菌培养上清存在约15000的特异性表达带，与GDNF成熟肽的分子质量吻合。结论：GDNF在MelC1信号肽指导下可以在链霉菌分泌表达。     

人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/TSLC1.方法:从正常皮肤组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA,克隆入pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体.结果:RT-PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带,TSLC1基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致.结论:TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆,为以后的研究奠定了基础.     

重组可溶性人CD137在CHO细胞中的表达

目的：获得表达人可溶性CDl37抗原的dhfr-CHO细胞抹。方法：将CDl37-hIgGlFc-pCD-NA3重组质粒及pSV2-dhfr质粒，运用脂质体介导法共转染CHO细胞。用G418筛选出阳性克隆，MTX递增浓度诱导人可溶性CDl37在dhfr-CHO细胞的表达。运用RT-PCR检测CDl37 mRNA转录水平，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测人CDl37可溶性蛋白在CHO细胞中的表达。结果：重组质粒转化细胞进行RT-PCR后，得到一大小为558bp的特异性条带，与人CDl37胞膜外区一致；重组质粒转化细胞进行SDS-PAGE得到一大小约为37KDa的奈带，与人CDl37-hIgGlFc融合蛋白大小基本一致。结论：获得了表达人可溶性CDl37的dhfr-CHO细胞株，为获得纯化的CDl37抗原、制备CDl37单抗奠定了基础。     

TNFR1BP/IgGFc融合蛋白载体的构建、表达及其生物学活性研究

目的 构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性.方法 将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和Western blot法检测转染细胞的培养上清中TNFR1BP/IgGFc融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验、细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNFR1的封闭作用.结果 经PCR和核苷酸序列测定证实TNFR1BP基因正确插入质粒pIG/3C.ELISA检测证实,在转染细胞培养上清中有融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验和细胞毒抑制实验证实融合蛋白能结合L929细胞表面的TNFR1,并能抑制分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)介导的细胞毒作用.结论 成功构建并实现TNFR1BP/IgGFc融合蛋白真核表达;体外实验证实此融合蛋白可通过与细胞表面TNFR1结合,从而拮抗sTNF-α介导的生物学效应.     

野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1真核表达载体的构建及其在小鼠足细胞中的表达

目的 构建野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1(dynactin-1)真核表达载体,并观察其在小鼠足细胞中表达。方法 以总RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增得到小鼠dynactin-1的全长cDNA,将该片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)-FLAG和pEGFP-N1;利用部位特异性突变插入方法构建突变型表达载体,经酶切和测序鉴定;各载体转染小鼠足细胞MPC5后,用蛋白质印迹分析法和免疫荧光显微镜法检测dynactin-1蛋白表达。结果 PCR扩增得到大小为3.8 kb的小鼠dynactin-1片段,连接到载体后,酶切鉴定电泳结果分别显示pcDNA3.1(+)-FLAG(5.4 kb)、pEGFP-N1(4.7 kb)以及小鼠dynactin-1(3.8 kb)片段,测序分析结果 显示克隆的野生型和突变型小鼠dynactin-1序列与数据库序列相同;蛋白质印迹分析法检测到重组dynactin-1的蛋白条带;免疫荧光显微镜观察到dynactin-1主要表达在小鼠足细胞的细胞质。 结论 成功构建了野生型和突变型小鼠dynactin-1真核表达载体,并在足细胞中表达,为进一步开展细胞生物学研究奠定了实验基础。     

抗PSMA膜外段单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)膜外段的单克隆抗体。方法 原核表达含有PSMA膜外段多肽的融合蛋白，免疫雌性Balb／c小鼠后取效价较高的小鼠行小鼠脾细胞与SP2／0细胞融合，以酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫细胞化学、免疫组织化学法筛选、鉴定分泌特异性抗：PSMA膜外段的单克隆杂交瘤细胞株。结果 经过ELISA初筛得到55个阳性杂交瘤细胞株，其中8株经免疫组化证实为可用于前列腺癌石蜡包埋组织切片的免疫组化染色。结论 获得了8株可持续分泌抗PSMA膜外段单克隆抗体的杂交瘤细胞株，产生的单抗以后可用于前列腺癌的诊断，并为前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。     

基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化

目的制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病的发病机制提供实验基础。方法采用PCR方法扩增人sorl1 cDNA编码区5 923～6 260 bp片段,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中。用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达重组质粒,用液相色谱法纯化基因重组蛋白。结果 PCR扩增产物为358 bp,其ATG和TGA之间的结构与人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp区完全一致。基因重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中高效表达,其表达产物存在于包涵体组分中。纯化的基因重组蛋白在SDS-PAGE中表现为单一条带,表观分子量约为13 000。结论人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp片段在原核细胞中大量表达,纯化后的基因重组蛋白可尝试用于抗体的制备。     

截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达

目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3.1 VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6 1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX 5X，在E.coli中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。对表达产物进行SDS PAGE和Western blot分析。通过改变宿主菌、培养基、IPTG浓度和培养温度等条件，提高目的蛋白的可溶性表达水平，使用GST Sepharose 4B亲合层析进行初步纯化。结果：选定VP6 氨基酸12～143片段为目的蛋白， PCR扩增其396?bp的编码基因片段，构建出pGEX 5X VP6 1。将该重组质粒转化E.coli后，SDS PAGE和Western blotting 分析均显示，含有截短VP6蛋白的重组融合蛋白GST::VP6 1在E.coli中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％。该蛋白主要以包涵体形式存在，经条件优化，最终通过低浓度IPTG、低温诱导提高重组蛋白的可溶性表达水平，GST亲和层析可对其进行初步纯化。结论：VP6 1蛋白在E.coli中可被高效表达和纯化，为下一步制备抗VP6的特异性单克隆抗体并用于免疫检测打下基础。     

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

入白细胞介素-13基因的克隆与表达

目的构建一个能在原核高效表达人白细胞介素－１３（ＨＩＬ－１３）的系统。方法采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获得ＨＩＬ－１３的ｃＤＮＡ,将其克隆至原核表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ后进行诱导表达。结果合成了特异编码ＨＩＬ－１３的ｃＤＮＡ,构建了原核表达质粒ｐＧＥＸ－２ＴＨＩＬ－１３,对其进行序列分析表明,表达质粒中的插入片段为ＨＩＬ－１３基因;诱导表达出含有ＨＩＬ－１３的融合蛋白谷光苷肽－Ｓ－转移酶－ＨＩＬ－１３（ＧＳＴ－ＨＩＬ－１３）,其相对分子质量为３９０００。结论（１）从Ｔ淋巴细胞中克隆出ＨＩＬ－１３基因。（２）ＨＩＬ－１３ｃＤＮＡ在原核细胞表达的蛋白占菌体总蛋白的３７％。     

阿尔茨海默病Aβ人抗体可变区片段基因的克隆和表达

目的 筛选出β淀粉样蛋白40 (Aβ40)的人源抗体单链可变区片段,克隆单链抗体的基因并在原核生物大肠杆菌表达,为阿尔茨海默病的诊断和治疗开辟新的途径。方法 先将Aβ40包被在免疫反应板上,后用来自正常人外周血淋巴细胞的单链抗体文库结合。经过5轮的生物淘金法筛选,从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TGl中随机挑选55个克隆进行ELISA测试,筛选出Aβ40特异的单链抗体并对其进行基因测序。将人源抗体单链可变区片段基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-s-转移酶(GST)融合的单链抗体。结果 ELISA测试表明,55个克隆中有33个克隆能结合Aβ40,Aβ40对10个克隆的竞争抑制率达到50％以上,而其中5个克隆的抗原结合表位在Aβ40的氨基端1-16个氨基酸之间。DNA测序结果发现,Aβ40单链抗体基因由768bp组成,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构。将单链抗体基因克隆到原核表达系统中诱导表达,得到相对分子质量为55000的GST融合抗体表达产物。结论利用非免疫途径筛选出阿尔茨海默病发病中起关键神经元毒性作用的Aβ40的人源抗体单链可变区片段,为该抗体的表达和临床应用打下了基础。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。