帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白寡聚体形成

目的 研究帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）患者血浆对α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的影响.方法 将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,37 ℃振荡孵育144 h,免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体形成情况,ELISA方法分析α-Syn寡聚体形成的相对质量浓度.结果 α-Syn在 PD患者血浆中形成寡聚体含量明显高于对照组.结论 PD患者血浆可促进α-Syn寡聚体形成.     

一种检测帕金森患者血浆促进α-突触核蛋白寡聚体形成能力的方法

目的 建立一种检测帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）患者血浆促进外源性α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的方法.方法 利用本室自制的鼠抗人α-Syn单克隆抗体建立检测α-Syn寡聚体的酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent,ELISA）方法.将不同质量浓度（200、100、50、25、12.5 μmol/L）重组人α-Syn在正常人和PD患者血浆中分别振荡孵育（37 ℃、280 r/min）24、48、72、96 h.用所建立的ELISA法检测振荡后血浆中的α-Syn寡聚体含量.结果 所建立ELISA方法可以特异性检测α-Syn寡聚体,不识别α-Syn单体.重组人α-Syn在质量浓度为100 μmol/L、血浆稀释3倍以下、振荡孵育48 h条件下可以在PD患者血浆中形成较多的寡聚体,并与对照血浆中形成的α-Syn寡聚体含量对比差异最大.结论 成功建立了一种检测PD患者血浆促进α-Syn寡聚体形成能力的方法,该方法可以用于诊断PD患者血浆的潜在病理变化.     

不同亚型的帕金森病及多系统萎缩患者血浆α-突触核蛋白寡聚体浓度分析

目的 比较不同亚型帕金森病（Parkinson's disease,PD）和多系统萎缩（multiple system atrophy,MSA）患者血浆促进α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的能力。方法 选择性别与年龄匹配的健康受试者（Control）、震颤为主型PD（tremor dominant,PD-TD）、姿势不稳与步态困难为主型PD（postural instability gait difficulty,PD-PIGD）、小脑萎缩型MSA（MSA of cerebellar type,MSA-C）和混合型MSA（MSA between cerebellar and parkinsonism type,MSA-C+P）患者各10例,抽取血浆,与重组人α-Syn振荡孵育。Western blotting法和ELISA法检测各组α-Syn寡聚体形成量。结果 PD和MSA组α-Syn寡聚体形成量显著高于对照组（P<0.05）。虽然PD组α-Syn寡聚体形成量略高于MSA组,但差异无统计学意义。亚型分析显示,α-Syn寡聚体形成量在PD-PIGD组高于PD-TD组（P<0.05）,在MSA-C组高于MSA-C+P组（P<0.05）。结论 PD与MSA及其不同亚型患者血浆促进α-Syn寡聚体形成的能力不同。     

帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白细胞毒性及其机制研究

目的 研究帕金森病（Parkinson's disease,PD）患者血浆对α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）细胞毒性的影响及其机制。方法 将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,采用免疫印迹法及酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法鉴定α-Syn寡聚体和磷酸化形成情况。在原代神经培养基中加入终浓度为5 μmol/L的α-Syn单体及寡聚体,同时添加30%（体积分数）PD血浆、正常人血浆和胎牛血浆,孵育14 d后,MTT及流式细胞技术观察细胞死亡情况。酶活力试剂盒检测各组原代神经元中蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）酶活力。结果 PD患者血浆较正常受试者（normal subject,NS）血浆可促使更多的α-Syn磷酸化和寡聚化。与NS血浆相比,添加到原代神经元培养物中的PD血浆导致更多细胞在细胞外α-Syn存在下死亡,同时伴有PP2A活力降低。结论 PD患者血浆中可能通过降低PP2A酶活力使α-Syn发生磷酸化,导致其聚集并进一步使得原代培养神经元死亡。     

α-突触核蛋白寡聚体抑制大鼠原代培养神经元突起早期生长

目的 观察人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和其形成的寡聚体对大鼠原代培养神经元突起生长的影响,明确α-Syn的生理功能,探讨其寡聚化对神经元的毒性及其在帕金森病发病机制中的作用.方法 制备α-Syn的寡聚体,向分组培养的大鼠脑皮质神经元培养基中添加,培养1、2和4h后固定,观察对神经元突起生长的影响.神经元的突起以成像显微镜观察测量,Western blotting法、免疫荧光法实验进行鉴定.结果 添加α-Syn寡聚体组的神经元培养至1、2和4h时,其突起的平均长度均小于对照组和添加α-Syn单体组(P＜0.05).增加α-Syn寡聚体浓度,随浓度增高神经元突起的平均长度与对照组差异越大(P＜0.01).Western blotting法和免疫荧光实验明确了外源性α-Syn寡聚体可以从培养基进入到神经元内.结论 α-Syn寡聚体在原代神经元生长初期对其突起生长具有抑制作用,这一现象可能与其在帕金森病发病机制中的作用有关.     

过氧化氢和帕金森病患者血清促进α-突触核蛋白向线粒体与细胞核转运

目的研究氧化应激和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者血清对α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)向线粒体以及细胞核转运的影响。方法将MES23.5多巴胺能神经细胞在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养,然后分别用过氧化氢(H2O2)以及PD和正常人血清处理,免疫荧光标记法观察不同处理对α-Syn向线粒体以及细胞核的转运以及对线粒体及细胞核的影响。比色法测定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、脂质氧化(malondialdehyde,MDA)和总抗氧化能力(totalanti-oxidation competence,T-AOC),观察血清的氧化应激水平。结果 H2O2和PD血清促进α-Syn向线粒体转运与细胞核转运,并造成线粒体皱缩、崩解,PD血清处理同时引起类似凋亡的核碎裂现象。PD血清的SOD、MDA和T-AOC高于对照血清。结论氧化应激和PD血清均可促进α-Syn向线粒体与细胞核转运,PD血清促进α-Syn向线粒体与细胞核转运可能与其氧化应激水平增高有关。     

脑卒中患者血浆中α-突触核蛋白及其寡聚体形成量变化的研究

目的 探讨脑卒中患者血浆中α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）含量的变化,以及血浆对α-Syn寡聚体形成的影响.方法 收集2012年3月至5月首都医科大学宣武医院神经科诊断为脑卒中的住院患者50例,另收集年龄和性别与之相匹配的30例健康人群为对照组.用ELISA法检测各组人群血浆中的α-Syn总量及寡聚体形成量.结果 脑卒中患者血浆α-Syn总含量及寡聚体形成量较对照组均有显著增加.结论 脑卒中患者血浆中α-Syn含量增高增强其寡聚体的形成.     

糖尿病患者血浆减少α-突触核蛋白的磷酸化和寡聚化

目的研究2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)患者血浆对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)磷酸化和寡聚化聚集的影响。方法收集首都医科大学宣武医院内分泌科T2D住院患者70例,另收集年龄和性别与之匹配的健康志愿者70例作为对照组。采集抗凝血,并分离血浆。将基因重组人α-Syn在患者和对照志愿者血浆中振荡孵育,ELISA法检测各组人群血浆中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量。结果 T2D患者血浆中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量较对照组均有显著降低(P<0.05),且其与年龄有相关性。结论 T2D患者血浆以年龄依赖的方式减少寡聚化和磷酸化α-Syn的形成。     

帕金森病和多系统萎缩患者红细胞中α-突触核蛋白寡聚体含量及其与临床症状的相关性

目的分析帕金森病(PD)和多系统萎缩(MSA)患者红细胞中的α-突触核蛋白寡聚体(RBC-O-α-Syn)含量及其与临床症状的相关性。方法收集2020年7月至2021年10月从首都医科大学宣武医院功能神经外科、神经内科招募的PD患者296例, MSA患者85例, 同期从北京老年纵向研究社区队列招募健康对照(HC)受试者403名。ELISA测试RBC-O-α-Syn含量。单变量线性回归模型分析各种运动和非运动评分, 如帕金森病统一评定量表(UPDRS)Ⅲ、多系统萎缩统一评定量表(UMSARS)Ⅲ、简易智力状态检查量表(MMSE)、快速眼动睡眠行为障碍-香港(RBDQ-HK)及蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分与RBC-O-α-Syn含量的相关性。受试者工作特征(ROC)曲线评估RBC-O-α-Syn区分PD、MSA患者和HC受试者的特异度、灵敏度和曲线下面积(AUC)。结果 HC组受试者年龄(70±8)岁;PD患者年龄(64±9)岁, 其中, 震颤为主型PD(TD-PD)115例(38.9%), 姿势不稳步态障碍为主型PD(PIGD-PD)132例(44.6%), H-Y分期为2期的患...     

α突触核蛋白与神经系统疾病的关系研究进展

α突触核蛋白(α-Syn)是一种小分子酸性可溶性蛋白,是帕金森病(PD)发病的病理基础,在PD的发生中起重要作用。该文对α-Syn的结构、功能及其导致PD的发病机制等方面进行了综述,结合近年来对遗传性脊髓小脑型共济失调2型(SCA2)与α-Syn关系的研究来阐述带有PD症状的SCA2的发病是否与PD有共同的发病基础,是否也是α-Syn异常聚集所致,尚待进一步考证。     

线粒体功能障碍、α-突触核蛋白与帕金森病

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元缺失,黑质残存神经元内出现路易小体为主要病理改变的神经退行性疾病。越来越多的证据显示线粒体复合体Ⅰ功能障碍是散发性PD的核心发病机制,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)异常聚集是PD病理学级联反应的关键事件。近年来,α-Syn与线粒体功能障碍的关系尤其引人注意,但至今对它们在PD中的作用机制并不完全清楚,二者间的相互作用尚不明确。本文综述了α-Syn与线粒体在PD发病中的关键作用以及二者在PD发病中的相互作用。对α-Syn及线粒体在PD发病中发挥作用的机制深入了解将对研发新的PD治疗方法具有重要意义。     

淫羊藿苷对基因转染PC12细胞α-突触核蛋白过表达和泛素-蛋白酶体系统的影响

目的观察淫羊藿苷在体外试验中对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)及相关蛋白表达的影响及其作用机制。方法 不同浓度的淫羊藿苷与转染α-Syn基因PC12细胞共孵育24h,应用RT-PCR法检测各组细胞α-Syn mRNA含量,Western免疫印迹法检测细胞中α-Syn、泛素化蛋白羧基端水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolase protein,UCH-L1)和Parkin蛋白的表达,观察淫羊藿苷对它们的影响。结果 淫羊藿苷浓度40～80μmol/L与转染α-Syn基因细胞孵育24h,能够明显减少模型细胞中α-SynmRNA含量,抑制Syn蛋白表达和聚集,增强UCH-L1和Parkin蛋白表达。结论 淫羊藿苷在体外对基因转染细胞的α-Syn过表达和聚集有明显抑制作用,其作用机制与抑制α-Syn合成和增强α-Syn降解有关。     

自噬介导α-突触核蛋白清除在帕金森病发生发展中的作用

帕金森病(Parkinson disease, PD)是一种常见的慢性神经退行性疾病, 严重影响患者的生活质量, 已成为社会面临的重要人口健康问题。PD的典型神经病理学特征是α-突触核蛋白(α-synuclein, α-Syn)在黑质-纹状体区的异常聚集, 造成多巴胺能神经元的变性坏死。随着研究的深入, 发现细胞自噬介导病理性α-Syn的清除过程参与PD的发病过程。自噬是细胞清除异常聚集蛋白和衰老受损细胞器的重要途径, 自噬清除α-Syn异常沉积可维持细胞稳态, 保护多巴胺能神经元。此外, 自噬过程受损引起α-Syn聚集, 增加α-Syn在脑内的传播, 促进多巴胺能神经元退变, 参与到PD的发生发展中。PD相关基因影响自噬调控, PD相关基因突变能导致溶酶体功能受损进而阻断自噬。同时异常聚集的α-Syn会进一步破坏自噬过程, 降低自噬清除能力, 增加神经毒性累积。自噬受损和α-Syn异常聚集是黑质多巴胺能神经元退行性变的重要机制。因此, 针对自噬和α-Syn异常聚集的研究可为PD的发病机制提供新的思路, 通过增加自噬通量, 减少α-Syn积累可能成为治疗PD的重要靶点。     

抑制葡糖脑苷脂酶对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白寡聚体形成及细胞自噬功能的影响

目的 研究抑制葡糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GBA）活性对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成及自噬功能的影响.方法 在培养MES23.5细胞外添加不同浓度的GBA活性抑制剂（conduritol-β-epoxide,CβE）,观察GBA活性的变化,同时在细胞外添加α-Syn单体使其进入细胞内并孵育48 h.使用双抗体夹心ELISA方法测定细胞内α-Syn寡聚体含量,观察细胞自噬活性、氧化应激和凋亡.结果 随着CβE质量浓度的增加,GBA活性呈质量浓度依赖性的下降,而细胞内α-Syn寡聚体的含量则呈质量浓度依赖性的增加;在CβE处理细胞,随着细胞外添加的α-Syn单体的质量浓度加大,自噬活性和氧化应激液增强,同时细胞凋亡数量增加.结论 抑制GBA活性导致细胞内α-Syn寡聚体增多以及依赖于α-Syn浓度的自噬活性和氧化应激增强和细胞凋亡增加.     

血清生长相关蛋白-43、α-突触核蛋白对小儿癫痫诊断价值研究

目的 探讨癫痫患儿血清生长相关蛋白-43(GAP-43)、α-突触核蛋白(α-Syn)水平,分析两者对小儿癫痫的诊断价值。方法 纳入2019年4月—2022年4月临汾市人民医院儿科诊治小儿癫痫患者80例为癫痫组,晕厥患儿50例为晕厥组,腹股沟斜疝患儿50例为对照组。利用酶联免疫吸附试验检测血清GAP-43、α-Syn水平;比较3组患儿间及不同临床特征癫痫患儿血清GAP-43、α-Syn水平差异;Pearson相关分析血清GAP-43、α-Syn与癫痫发作严重程度量表评分(NHS3)的相关性;受试者工作特征曲线分析血清GAP-43、α-Syn对小儿癫痫的诊断价值。结果 血清GAP-43水平比较,癫痫组<晕厥组<对照组(F/P=821.793/<0.001),血清α-Syn水平比较,癫痫组>晕厥组>对照组(F/P=419.176/<0.001);癫痫患儿血清GAP-43在癫痫局灶性发作、无认知功能损害者中升高(t/P=8.745/<0.001,10.070/<0.001),α-Syn水平在癫痫局灶性发作、无认知功能损害者中降低(t/P=4.2...     

寡聚化α-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴消化道中的表达

目的 研究寡聚化α-突触核蛋白(oligomer-α-synuclein,oligo-α-Syn)在不同年龄段食蟹猴消化道中的表达差异.方法 Western blotting和ELISA方法检测oligo-α-Syn在不同年龄段食蟹猴消化道中的表达.结果 在老年食蟹猴的食管、胃底、十二指肠、空肠、回肠和结肠中,寡聚化α-Syn浓度较青年与中年猴显著增加,且差异有统计学意义(P＜0.01).结论 食蟹猴消化道的各部位中α-Syn寡聚体表达具有增龄性变化.     

不同剂量左旋多巴对百草枯毒性作用影响的实验研究

目的探讨帕金森病小鼠模型中不同剂量左旋多巴对百草枯毒性作用的影响及相关机制。方法选用不同剂量左旋多巴分别在注射百草枯一定时间的C57BL小鼠（72只）腹腔内注射,利用免疫组化、Western印迹法等观察黑质部位百草枯沉积和多巴胺能神经元变性以及α-突触核蛋白（α-Syn）聚集,并检测纤维状α-Syn经左旋多巴孵育后其聚集的改变情况。结果在注射百草枯之前腹腔注射小剂量左旋多巴抑制百草枯诱导的黑质部位多巴胺能神经元变性,α-Syn聚集减少;大剂量左旋多巴则促进黑质部位多巴胺能神经元变性。左旋多巴可以解聚已经形成的纤维状α-Syn。结论小剂量左旋多巴竞争性抑制百草枯通过血脑屏障进入中枢神经系统,起到了神经保护作用;大剂量左旋多巴则使已经形成的纤维状α-Syn解聚,出现明显的毒性作用。     

α-突触核蛋白促进大鼠原代培养神经元突起生长

目的研究人α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)对神经元突起生长的作用。方法原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,细胞外添加α-Syn蛋白,测定不同时间神经元突起的长度;观察添加不同浓度的α-Syn蛋白后神经元突起的生长情况。结果α-Syn处理组神经元突起的平均长度在培养1h、2h和4h时均明显大于对照组,α-Syn的这一作用可被其特异性单克隆抗体阻断;向培养基中添加不同浓度的α-Syn后,神经元突起的长度随α-Syn浓度的增加而增加。结论α-Syn具有促进神经元突起生长的作用,并且呈明显的量-效关系。     

帕金森病患者共核蛋白基因复制子的调查及血清共核蛋白表达水平的研究

帕金森病(PD)的发病机制与遗传因素密切相关,调查形成中脑黑质多巴胺能神经元内病理性路易小体(LB)的主要成分α-共核蛋白的基因(SNCA)在散发PD患者的突变;同时了解α-共核蛋白在血液中的浓度.方法 抽取210名散发性PD患者和80名正常人的静脉血,分离血清后,分别提取RNA和基因组DNA;采用实时定量PCR方法分析SNCA基因的剂量变化以及mRNA表达的水平;应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中α-共核蛋白的表达水平.结果 SNCA基因外显子1基因组水平相对定量结果显示,1个散发PD患者比值为1.6,其余PD患者和正常个体的比值在0.8～1.2之间;基因组水平比值增加的PD患者mRNA表达水平与其他PD患者及正常个体比较显著增加(P＜0.05);但该患者血清中α-共核蛋白表达水平与其他PD患者及正常个体之间差别没有统计学意义(P＞0.05).结论 汉族散发PD患者中存在SNCA基因双拷贝复制,但出现频率极低;血清中α-共核蛋白的检测目前不能视为PD分析的有效生物学指标.     

α-突触核蛋白N 端结构域和电压依赖阴离子通道1 相互作用的分子机制

【立论依据】 帕金森病是主要发生在中老年人群的神经系统退行性变。目前认为与基因、环境和老化相关,三者主要作用于神经细胞线粒体导致其功能障碍。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是第一个发现的帕金森病致病基因编码的蛋白,是帕金森病病理标志路易体的主要成分。但到目前为止,α-Syn对细胞线粒体的致病机制尚不十分清楚。我们课题组前期工作首次发现,α-Syn可定位于线粒体内外膜,过表α-Syn可以引起线粒体膜电势下降及细胞色素C 释放到胞浆诱导凋亡;进一步发现线粒体膜渗透性转换孔(mPTP)开放,而α-Syn N端结构域(α-Syn/N)在这个过程中起重要作用。文献报道,α-Syn N端的62、63、65 位氨基酸可能是其定位于膜的关键位点。线粒体mPTP的外膜孔主要由电压依赖阴离子通道1(VDAC1)构成,我们预实验发现VDAC1和α-Syn存在相互作用。那么,α-Syn/N是否和VDAC1发生相互作用,导致mPTP开放而引起线粒体介导的凋亡呢?α-Syn/N的62、63、65 位氨基酸在这个过程中是否起重要作用呢? 【设计思路】 首先证明α-Syn/N和VDAC1之间存在相互作用,并过表达α-Syn/N,剪除α-Syn/N(α-Syn/delN),检测mPTP是否开放以及是否发生线粒体介导的凋亡。而后,构建α-Syn的62、63、65 位氨基酸突变体,检测过表达这些突变体对mPTP和线粒体介导的凋亡的影响,以及检测它们是否和VDAC1发生相互作用。 【实验内容】 (1)在HEK293T细胞中,过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN,用免疫共沉淀和免疫细胞化学的方法检测相互作用。(2)构建带VDAC1 基因的质粒,在HEK293T细胞中分别共表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN 和VDAC1,用荧光共振能量转移(FRET)的方法检测是否存在直接相互作用,并再通过GST-pulldown方法验证。(3)在HEK293T细胞中,检测过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN对mPTP开放和线粒体介导的凋亡的影响。(4)构建α-Syn突变体(Q62A、V63A、N65A),检测过表达这些突变体对mPTP开放和线粒体介导的凋亡的影响。(5)检测这些突变体和VDAC1之间是否存在相互作用,方法同前。 【材料】 HEK293T 细胞,表达α-Syn,α-Syn/N,α-Syn/delN,Q62A,V63A,N65A 的质粒,线粒体提取试剂盒,JC-1 荧光探针(检测线粒体膜电势),mPTP 检测试剂盒。 【可行性】 我们的前期工作提示:α-Syn/N导致mPTP开放;α-Syn和mPTP外膜的孔的组成蛋白VDAC1之间存在相互作用;并且我们已经成功构建了过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN的细胞模型;以及α-Syn突变体(Q62A、V63A、N65A);并掌握了后续实验的全部方法。 【创新性】 目前关于α-Syn/N与mPTP 相关蛋白VDAC1的研究未见报道,本研究尝试揭示α-Syn与线粒体膜孔蛋白之间的确切关系,对进一步明确α-Syn引起线粒体介导凋亡的分子机制、明确帕金森病的致病机制具有重要意义,进而为帕金森病治疗的新靶点探讨提供线索。