人小龄胚胎神经干细胞的分离培养、扩增及鉴定

目的 探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件，从而在体外大量扩增神经干细胞；并观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎脑分离神经干细胞，部分细胞冻存，另一部分细胞进行体外培养。采用无血清培养液，加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖，进行体外扩增、传代培养。采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元及胶质细胞。结果 从人胚胎脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经干细胞球，这些神经干细胞球可在体外扩增及传代培养。免疫荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为神经上皮干细胞蛋白(nestin)表达阳性细胞。贴壁后可以分化出神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性的细胞。经冻存后的胎脑细胞也能培养出具有同样特征的神经干细胞。结论 在含有EGF和bFGF的无血清培养液中，从人胚胎脑能分离培养出神经干细胞，并能在体外大量扩增。这为人类神经干细胞的进一步研究和应用提供了材料。     

GDNF对培养脊髓运动神经元的影响

目的　研究不同浓度胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)对大鼠胚胎脊髓运动神经元生长活性的作用。方法　取大鼠胚胎脊髓腹侧组织进行原代体外分离培养 ,从细胞形态学及应用MTT法观察GDNF对大鼠脊髓运动神经元的影响。结果　GDNF能明显促进体外培养的大鼠脊髓运动神经元存活及突起的生长 ,并且有剂量依赖的趋势。结论　不同浓度GDNF对体外培养大鼠胚胎脊髓运动神经元有不同程度的促生长作用。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定

目的　 从成年小鼠脊髓中培养神经干细胞 ,并对其进行鉴定和诱导分化。方法　 成年C5 7小鼠 ,悬浮培养神经干细胞技术。结果　培养 1～ 2周时 ,培养液中即可出现神经干细胞克隆球。该克隆球具有很强的自我增殖能力 ,可多次传代。免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量的神经干细胞特征性的中间丝———巢蛋白(Nestin) ;经 1%胎牛血清诱导后可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特征性标志物β tubulinIII、胶质纤维酸性蛋白 (Gliafibrillaryacidicprotein ,GFAP)和RIP ,提示它们可朝神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化。 结论　 本研究结果提示正常成年C5 7小鼠脊髓中含有神经干细胞 ,在体外条件下可以大量增殖 ,经诱导后可朝神经元和胶质细胞的方向分化     

人胚脊髓神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨人胚脊髓神经干细胞的体外培养和分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:利用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚脊髓组织中分离培养出神经干细胞并用血清诱导其分化,应用免疫荧光细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果:从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF和bFGF共同存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球,表达神经干细胞的标志物Nestin,经血清诱导后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞并表达特异性抗原NSE、GFAP和CNP。结论:在体外培养条件下可从人胚脊髓组织中培养出神经干细胞,它可为神经干细胞的基础研究和临床应用提供材料。     

无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞

背景：神经干细胞的体外培养成功为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路,但神经干细胞的分化和功能修复机制尚不甚清楚,移植后的细胞能否与体内细胞结合以及建立起正常的神经系统突触联系急需解决。 目的：在无血清条件下体外分离培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在天津市环湖医院神经干细胞室完成。 材料：孕14~16 d的SD大鼠,由北京维通利华实验动物中心提供。 方法：取孕鼠胚胎的脑海马组织,通过机械分离和胰蛋白酶消化结合法体外分离培养神经干细胞,在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及B27的无血清DMEM/F12培养基中传代扩增。取原代培养7 d的神经干细胞,制备单细胞悬液,接种后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液诱导3 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化过程,并行免疫荧光染色鉴定。通过细胞免疫化学染色检测诱导分化后的细胞类型。 结果：分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断分裂增殖,8 d左右即可形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,悬浮生长,免疫荧光染色巢蛋白呈阳性表达。神经干细胞球诱导5 d,免疫细胞化学染色后可见胶质纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇酶呈阳性表达的细胞。 结论：体外无血清条件下,分离培养的神经干细胞生长状态良好,且具有自我更新和增殖能力,诱导后能够向神经元及星形胶质细胞方向分化。     

人胚海马神经干细胞体外培养及分化研究

目的 研究人胚胎海马神经干细胞体外长期培养的条件和其在自主分化条件下的分化能力和分化特点。方法 从人胚胎海马分离神经干细胞。采用无血清培养法，进行体外培养、扩增，形成神经球。使神经球贴壁分化，分化培养基不含有任何细胞有丝分裂促进剂。使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记分裂增生的细胞，观察细胞的分裂增殖情况。使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞及其在不加诱导剂下的自主分化能力。结果 从人胚胎海马分离的神经干细胞具有增殖能力，细胞倍增时间为3．2d。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。细胞贴壁分化后可以出现Nestin、GFAP、Tuj-1表达阳性的细胞。神经干细胞共培养6个月，传代14代。结论 分离培养的海马神经干细胞具有自我更新和增殖能力，可以长期培养。在不加任何诱导剂的自主分化条件下可以向神经元、胶质细胞分化。少突胶质细胞的培养需要不同的培养条件。分离培养的干细胞具有神经干细胞的特征。可用于基础和临床的相关研究。     

胚胎大鼠神经干细胞培养及分化鉴定的实验研究

目的建立胚胎大鼠神经干细胞体外培养及分化鉴定的方法。方法分离不问孕龄(13- 18d)SD胎鼠脑室下区、中脑及海马等部位组织,在含有表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子及N-2 添加剂的DMEM培养基中悬浮培养,形成神经球体后撤除生长因子,经消化传代于含胎牛血清培养基中贴壁生长。应用免疫荧光方法检测原代细胞特异性标记巢蛋白、神经元标记微管蛋白-β、胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白,以及少突胶质细胞标记半乳糖脑苷的表达。结果胎鼠脑组织不同部位均可分离出神经干细胞,体外培养可以向神经元和神经胶质细胞分化,孕龄13d与18d胎鼠产生神经干细胞球体的能力不同,前者优于后者。结论 (1)胚胎大鼠脑内不同部位来源的组织生成神经干细胞球体数量和质量基本相同,但是不同胎龄的鼠脑组织产生神经干细胞球体的能力有所差异。(2)神经干细胞具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

GFP^＋-大鼠胚胎脊髓源神经干细胞的培养、分化和Neuregulin-1的表达

目的:从GFP -大鼠胚胎脊髓分离和培养神经干细胞(NSC),观察NSC的分化功能和Neuregulin-1的表达。方法:从孕16d的GFP -大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞,用免疫组织化学方法观察神经球的Neuregulin-1表达及鉴定分化的细胞类型。结果:从大鼠胚胎脊髓能分离、培养出NSC。神经球能表达Neuregin-1和Nestin,并能进一步分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:从GFP -大鼠胚胎脊髓能分离和培养出NSC,该NSC具有分化为用于治疗中枢神经疾病的多种神经细胞的潜能。     

参芪液对成人骨髓问质干细胞的诱导分化作用

目的探讨参芪液体外对成人骨髓间质干细胞(MSC)定向诱导分化为神经元的作用.方法从成人肋骨分离MSC,体外培养扩增,并传代至第5代.含10 mg/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养液预诱导24h,再用含不同浓度参芪液的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元.免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增5代后,加入参芪液诱导,可见MJSC胞体收缩,突起伸出.免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性.神经分化的定量分析显示NSE、NF阳性细胞分别为(79.5±2.5)%和(76.5±2.3)%.结论参芪液在体外可以诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞.     

Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicity and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors

Besides their capacity to give rise to neurons and/or glia, neural stem cells (NSCs) appear to inherently secrete neurotrophic factors beneficial to injured neurons. To test this potential, we have implanted NSCs onto or adjacent to spinal cord cultures. When NSCs were placed adjacent to the spinal cord sections, motor neuron axons grew toward the NSCs. Furthermore, conditioned medium from NSCs cultures was also able to induce similar axonal outgrowth, suggesting that these NSCs secrete soluble factors that have tropic and/or trophic properties. ELISA revealed that the NSCs secrete glial cell-line-derived factor (GDNF) and nerve growth factor (NGF). Interestingly, preincubation of the conditioned medium with GDNF-blocking antibodies abolished axonal outgrowth. We also showed that NSCs can protect spinal cord cultures from experimentally induced excitotoxic damage. The neuroprotective potential of NSCs was further confirmed in vivo by their ability to protect against motor neuron cell death.     

携带神经干细胞肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活分化

摘要 背景：多项研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,肌基膜管具有良好的细胞、组织相容性和降解性,那么能否将二者结合起来构建一个新的神经组织工程支架？ 目的：以神经干细胞为种子细胞,以肌基膜管为支架,观察携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活与分化情况。 方法：体外分离培养大鼠神经干细胞,并进行鉴定。用化学萃取方法制作去细胞骨骼肌基膜管支架,将神经干细胞移植入肌基膜管支架培养7 d后,用免疫组织化学方法检测神经干细胞的存活及分化情况,扫描电镜观察其超微结构。 结果与结论：神经干细胞分离培养第5天,Nestin免疫荧光染色可见大量神经球。加血清诱导神经干细胞分化至7 d,进行抗NF、抗GFAP免疫荧光染色,镜下可见NF、GFAP阳性细胞,证明培养的神经干细胞具有多项分化潜能。苏木精-伊红染色法显示肌基膜管中肌细胞成分已消失,肌基膜管支架内主要是大致平行的管道。携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架免疫荧光染色证明,神经干细胞在支架内仍具有干细胞特性,并可分化为神经元和神经胶质细胞。扫描电镜显示神经干细胞可以稳固地贴附在肌基膜管内,提示制备的神经组织工程支架具有良好的生物相容性,可以进行体内移植治疗脊髓损伤等神经系统疾病。 关键词：肌基膜管;组织工程支架;神经干细胞;移植;脊髓损伤 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.003     

Induced pluripotent stem cell-derived neural stem cell therapies for spinal cord injury

The greatest challenge to successful treatment of spinal cord injury is the limited regenerative capacity of the central nervous system and its inability to replace lost neurons and severed axons following injury. Neural stem cell grafts derived from fetal central nervous system tissue or embryonic stem cells have shown therapeutic promise by differentiation into neurons and glia that have the potential to form functional neuronal relays across injured spinal cord segments. However, implementation of fetal-derived or embryonic stem cell-derived neural stem cell therapies for patients with spinal cord injury raises ethical concerns. Induced pluripotent stem cells can be generated from adult somatic cells and differentiated into neural stem cells suitable for therapeutic use, thereby providing an ethical source of implantable cells that can be made in an autologous fashion to avoid problems of immune rejection. This review discusses the therapeutic potential of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cell transplantation for treatment of spinal cord injury, as well as addressing potential mechanisms, future perspectives and challenges.     

脊髓来源神经干细胞分离培养及向雪旺氏细胞的诱导分化

目的 探讨新生大鼠脊髓来源神经干细胞(NSCs)的分离培养及在体外一定条件下向周围神经雪旺氏细胞分化的可行性. 方法 分离新生大鼠的脊髓组织,在含有B27(终浓度1%)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)(终浓度均为20 μg/L)培养基中分离培养出NSCs.用复合诱导因子(10%FBS+5 μmol/L血小板凝集抑制剂+10 ng/mL bFGF+5 ng/mE血小板源性生长因子)在体外诱导NSCs分化为雪旺氏细胞.免疫荧光细胞化学方法[一抗为p75、S-100、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)]鉴定体外诱导分化结果.结果 培养的新生大鼠脊髓组织细胞nestin染色表达阳性;分离培养的大鼠脊髓来源NSCs经诱导分化后形态类似雪旺氏细胞,免疫荧光细胞化学方法显示诱导后细胞表达雪旺氏细胞的表面标志,GFAP、S-100和P75表达阳性.结论 新生大鼠脊髓来源NSCs可以在体外诱导分化为雪旺氏细胞.     

Neural differentiation of embryonic stem cells induced by conditioned medium from neural stem cell

Embryonic stem cells can proliferate indefinitely and are capable of differentiating into derivatives of all three embryonic germ layers in vitro, including the neural lineage. The main objective of this study is to test the effects of neural stem cell conditioned medium on the neural differentiation of mouse embryonic stem cells. When cultured in neural stem cell conditioned medium, mouse embryonic stem cells can form floating cell spheres composed of many nestin-positive cells. After trypsinization and growth on gelatin, these embryonic stem cell-derived neural progenitor cells can be expanded for more than 3 months without loss of neural progenitor characteristics. Both neuronal and glial cells can be readily generated from these cells under differentiation conditions. Thus, neural stem cell conditioned medium is a highly potent reagent for inducing the development of mouse embryonic stem cells into the neural lineage, especially neural progenitor cells.     

体外培养人类神经干细胞神经球中髓鞘的形成

目的：探索人类神经干细胞的体外培养条件和其形成的神经球的超微结构。方法：从胎脑皮质中机械分离细胞，N2培养基培养和扩增人类神经干细胞，应用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。对形成的神经球应用透射电镜进行超微结构研究。结果：从胎儿的脑皮质中成功分离培养出神经干细胞，形成典型的神经球，大部分细胞表达神经干细胞的标志物波形蛋白，细胞贴壁后可诱导分化 为神经元和胶质。早期培养的神经球中有典型的髓鞘形成。结论：从胎儿的脑皮质中成功地分离、培养出人类的神经干细胞，细胞呈悬浮状态生长，形成神经球。这种早期培养的神经干细胞有形成髓鞘的能力，可作为治疗人类脱髓鞘病变的潜在细胞来源。     

人胚脑与脊髓神经干细胞体外生物学特性的差异

目的:探讨人胚脑源性神经干细胞和脊髓源性神经干细胞的体外培养和分化的差异。方法:从人胚脑组织和脊髓组织中分离培养神经干细胞,分为EGF组、bFGF组、EGF±bFGF组,在连续传代过程中观察并比较神经干细胞体外培养特性的差异:用血清诱导神经干细胞分化,观察其分化状况的不同。结果:从人胚脑组织分离的细胞在bFGF 单独存在时无法形成神经球,在EGF或EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球;从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球。同样在EGF±bFGF存在的情况下,脑源性于细胞的增殖速度较快。经血清诱导后,脑组织来源的干细胞分化为NSE阳性细胞数明显多于脊髓组织来源的干细胞,二者之间的差异具有显著性(P<0．05)。结论:脑源性和脊髓源性神经干细胞在生长和分化方面有明显差别:脑源性神经干细胞可在bFGF或EGF士bFGF存在的情况下长期传代,而脊髓源性神经干细胞只能在EGF±bFGF存在的情况下长期传代,脑源性干细胞的增殖能力明显高于脊髓源性干细胞;脑源性干细胞较脊髓源性干细胞更易分化为神经元。     

人类神经干细胞的长期培养和传代

目的 探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。方法 采用机械方法从胎脑中分离神经细胞，应用N2培养基进行培养，bFGF和EGF刺激细胞扩增；传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果 从胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞，培养条件下呈悬浮状态生长，形成神经球，绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashil两种神经干细胞的标志物；这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞，早期的培养有少量的少突胶质细胞；在这种培养条件下，神经干细胞生长速度较慢，而采用切割神经球的方法保持了细胞间的，神经干细胞可获得较大的扩增速度。结论 在体外的培养条件下，可从胎脑组织中培养出神经干细胞，它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。