犬牙周膜细胞和骨髓基质细胞相互作用的体外实验研究

目的:研究牙周膜细胞(PDLCs)和骨髓基质细胞(BMSCs)共培养是否更利于牙周组织再生。方法 :用组织块法培养PDLCs,用全血贴壁法培养BMSCs,检测它们的成骨、成脂诱导分化能力。用Transwell小室共培养这两种细胞,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测共培养后这两种细胞的增殖能力及部分基因的表达变化。结果:PDLCs和BMSCs具有多向分化潜能。共培养能促进它们各自增殖,上调Ⅰ型胶原(COLI)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、核心结合因子2(RUNX2)的表达。结论:PDLCs和BMSCs共同运用作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

骨桥蛋白与矿化液诱导牙髓干细胞向成骨细胞分化的对比研究

目的:比较骨桥蛋白(OPN)和矿化液对牙髓干细胞(DPSCs)向成骨细胞分化的作用。方法:矿化液培养DPSCs作为矿化液组,添加适宜浓度OPN作为OPN组,茜素红染色法检测矿化结节的形成;RT-RCR检测骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨钙蛋白(OCN)、Ⅰ型胶原(Col-1)等骨源性基因表达情况。结果:茜素红染色显示诱导培养28 d后2组出现的矿化结节数量相近(P>0.05)。OPN诱导培养7 d后2组DPSCs骨源性基因表达均成阳性,其中OPN组BSP基因表达水平高于矿化液组(分别为0.864±0.112和0.514±0.068,P<0.05);OPN组Runx-2基因表达水平低于矿化液组(分别为0.186±0.017和0.324±0.058,P<0.05);Col-1及OCN基因表达水平相近(P>0.05)。结论:OPN和矿化液对DPSCs的诱导能力相近。     

Runx2、Osterix转录因子过表达驱动内皮细胞成骨分化的机制探讨

目的:探讨Runx2和Osterix (OSX)过表达对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成骨分化的调控作用.方法:通过慢病毒载体,将Runx2和Osterix基因分别转染入HUVECs.通过碱性磷酸酶(ALP)染色、半定量活性检测,探讨过表达Runx2和Osterix对HUVECs成骨分化的影响.通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色检测成骨相关标志物Runx2、OSX、ALP、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)在HUVECs中的表达.采用GraphPad Prism 6.01软件包对数据进行统计学分析.结果:Runx2过表达有利于HUVECs的成骨分化,而Osterix过表达则无此作用.HUVECs转染Runx2过表达慢病毒后,成骨相关基因Runx2、OSX、ALP、BSP、OPN及OCN的转录水平上调,同时Runx2、OSX、OPN及OCN的蛋白表达水平亦有所上调.结论:Runx2过表达可促进HUVECs的成骨分化.     

牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化实验

目的:探讨人牙周膜干细胞(Periodontalligament stem cell,PDLSCs)向成骨细胞定向分化潜能,从细胞、分子和基因水平分析矿化诱导过程中细胞形态、功能变化。方法:将免疫磁珠分离的人PDLSCs矿化诱导,通过倒置显微镜观察诱导细胞形态变化,ELISA法检测诱导细胞碱性磷酸酶活性(ALPase)、RT-PCR、Western blot及免疫化学染色分析其成骨相关基因、蛋白表达变化,茜素红染色法检测其矿化结节形成情况来诱导细胞做对照。结果:矿化诱导14d,细胞形态呈成骨样短突起、多角形改变,诱导7d、14d ALPase活性显著增强。21d,诱导细胞高丰度表达骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)、牙骨质附着蛋白(CAP)及I型胶原(COLⅠ)mRNA,而对照组只有COLⅠmRNA弱表达。同时,Western blot及免疫化学染色均显示诱导细胞分泌骨涎蛋白(BSP)。21d,仅诱导组形成大量矿化结节。结论:人PDLSCs在矿化液诱导下可向成骨细胞分化,具有成骨细胞的形态、表型和功能特点,有望成为牙周及种植体周围骨缺损修复再生的理想的种子细胞。     

矿化液诱导人前磨牙牙髓干细胞向成骨细胞样细胞的分化

目的:探讨矿化液诱导人前磨牙牙髓干细胞(HDPSCs)向成骨细胞样细胞分化的潜力.方法:矿化液诱导前磨牙HDPSCs 28d,于诱导的第7、28天时,应用酶化学染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达;第14、21、28天时,应用茜素红染色观察细胞矿化情况;于诱导的第0、3、5、7、14、21、28天时,采用RT-PCR法检测其ALP、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨涎蛋白(BSP)和骨钙素(OCN)的基因表达;Western印迹分析、免疫细胞化学染色检测BSP及OCN蛋白的表达.结果:经矿化液诱导后,前磨牙HDPSCs ALP染色阳性,形成钙结节.诱导第3天,细胞ALP mRNA呈高表达;DSPP始终不表达;BSP、OCN mRNA于第5天开始表达,并随时间延长而表达增高;BSP蛋白表达趋势与其RT-PCR结果一致;第5天时OCN染色阳性.结论:前磨牙牙髓干细胞具有向成骨细胞样细胞分化的潜能,有望成为骨组织工程的种子细胞.     

17β雌二醇对人牙周韧带细胞表达碱性磷酸酶和骨保护素因子的影响

目的 探讨17β雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)对人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的影响.方法 采用组织块法培养hPDLC,培养基中加入不同浓度17β-E2,对硝基酚磷酸酯法检测ALP活性;ELISA法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法确定OPG含量.结果 各浓度组17β-E2作用于hPDLC 14 d和21 d后均可促进ALP的表达(P＜0.05);生理浓度(1 nmol/L)促进OPG蛋白分泌和mRNA表达(P＜0.05),72 hOPG蛋白分泌量达(4714.89±71.48)ng/L;高浓度(100 nmol/L)对OPG分泌无影响(P＞0.05),72 h OPG蛋白分泌量为(1932.04±51.59)ng/L,但降低了OPG mRNA表达(P＜0.05).结论 17β-E2可能通过促进ALP和OPG的表达介导局部牙周组织的骨保护作用.     

人牙髓干细胞在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的实验研究

目的：探讨矿化液诱导条件下人牙髓干细胞( human dental pulp stem cells,HDPSCs)在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的潜力。方法将HDPSCs接种于钛金属板表面,于第3、7d时观察其增殖状态。将HDPSCs接种于钛金属板表面进行矿化液诱导,于诱导的第0、3、5、7、14、21、28d时,采用RT-PCR检测其牙本质涎磷蛋白( DSPP)、碱性磷酸酶( ALP)、骨涎蛋白( BSP)和骨钙素( OCN)的基因表达。 Western印迹分析、免疫荧光检测BSP及OCN蛋白表达。对照组为矿化液诱导培养皿中的HDPSCs,检测指标、方法基本相同,免疫细胞化学染色检测OCN蛋白表达。结果钛金属板上 HDPSCs增殖迅速,表现出良好的生物相容性。两组细胞均自诱导第3天ALPmRNA呈高表达、DSPP始终不表达。培养皿组BSP、OCNmRNA于第5天开始表达,并随时间延长而表达增高;钛金属组BSP、OCNmRNA表达于第14天出现第一峰值,随后有所下降,28天再次升高。两组BSP蛋白表达趋势与其RT-PCR结果一致,第5天 OCN染色阳性。结论钛金属表面 HDPSCs 经矿化液诱导向成骨细胞样细胞分化。     

稀土元素铈对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的体外实验研究

目的:研究铈离子对体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力的影响。方法:分离培养小型猪骨髓间充质干细胞,分别用含有1×10-5mol/L CeCl3的成骨诱导液和单纯成骨诱导液进行培养;然后用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测两组细胞诱导培养1、7、14、21 d的ALP活性;用实时荧光定量PCR分析两组细胞诱导培养14 d时的成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA的表达水平。结果:诱导培养1、7、14、21 d后,CeCl3组各时间点的ALP活性均较对照组显著增加(P<0.05);诱导14 d后,CeCl3组的各成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论:CeCl3能促进BMSCs的成骨分化。     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞群骨钙素的影响

目的研究人牙周膜细胞群(human periodontal ligament cell populations,hPDLPs)在釉基质蛋白(em-dogain,EMD)诱导下骨钙素(osteocalcin,OCN)表达的改变。方法组织块法分离培养人牙周膜细胞,实验组用含100 mg/L EMD的培养液诱导6 d,对照组不经EMD诱导培养。免疫细胞化学和实时定量聚合酶链反应(polymer-ase chain reaction,PCR)检测成牙骨质细胞矿化相关蛋白OCN的表达。结果免疫细胞化学结果显示,实验组和对照组hPDLPs细胞胞浆均可见黄色或棕黄色颗粒,OCN表达呈阳性;实验组hPDLPs的OCN检测平均光密度值为0.172 43±0.014 85,对照组为0.167 01±0.017 03,组间差异无统计学意义(t=0.757,P=0.459);实时定量PCR检测结果显示,实验组骨钙素相对表达量是对照组的1.13倍。结论 EMD对hPDLPs的OCN表达无明显影响。     

人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞与人牙周膜干细胞成骨分化能力的对比研究

目的:比较人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesechymal stem ceils,hUCWJMSCs)与人牙周膜干细胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力.方法:体外培养hUC-WJMSCs和hPDLSCs.MTT法检测细胞增殖情况;成骨诱导后测定细胞的ALP活性,茜素红染色检测细胞矿化能力,Real-timePCR分析OPN和Runx2基因的表达.结果:hUCWJMSCs增殖能力高于hPDLSCs;经矿化诱导后hPDLSCs ALP表达、矿化结节形成高于hUCWJMSCs(P＜0.05);Runx2在hPDLSCs中表达高于hUCWJMSCs(P ＜0.05);而hUCWJMSCs中OPN表达高于hPDLSCs(P＜0.05).结论:hUCWJMSCs、hPDLSCs均具有成骨分化能力,hPDLSCs成骨分化能力较强.     

体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞表型特征的研究

目的 对体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞的表型特征进行研究探讨。方法 组织块 法培养人牙周膜细胞，放射免疫法检测条件培养基中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣＮ）的分泌活性，免疫 组化法检测非分泌型的ＡＬＰ和ＯＣＮ的表达，原位杂交方法检测二者的ｍＲＮＡ水平的表达。结果 人牙 周膜细胞具有成骨细胞的部分表型，碱性磷酸酶在蛋白水平包括分泌和非分泌型及基因转录水平都有一 定的表达，随培养时间的变化不大；而不具有成熟的成骨细胞的表型特征——骨钙素的表达，其无论是在 基因和蛋白水平都没有表达二这一结果为进一步研究人牙周膜细胞在机械力作用下参与骨改建打下基础。     

Fundamental study of application of umbilical cord mesenchymal stem cells to the periodontium to aid healing after autotransplantation of teeth

After autotransplantation of teeth the healing of periodontal tissue regulates the patient's prognosis. Umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSC) have shown excellent pluripotent and proliferation potential. In the present study we investigated the characteristics and developmental capability of osteogenic differentiation to find out whether human UCMSC promote periodontal healing. UCMSC were obtained by primary culture and identified using flow cytometry. Flow cytometry, real-time polymerase chain reaction (PCR), Western blotting, assays of alkaline phosphatase activity, and alizarin red staining were used to assess the potential for hUCMSC to proliferate and differentiate in vitro. Both dentine and predifferentiated or undifferentiated cells were transplanted subcutaneously onto the backs of immunodeficient mice to mimic periodontal tissue healing in vivo. The result showed that hUCMSC were readily obtained, and expressed numerous mesenchymal stem cell markers. Expression of stemness markers decreased notably during osteogenic differentiation. Through investigation of different time points, we found that the osteogenic procedure could be activated and detected at day 7. In the in vivo experiments, the predifferentiated hUCMSC showed increased ability to form cementum-like deposits surrounded by fibroblast-like tissue on the surface of the dentine. In conclusion, the potential for proliferation and differentiation, and the ability to form cementum-like tissue, suggest that hUCMSC are promising candidates as a source of mesenchymal stem cell for sources of periodontal healing after autotransplantation of teeth.     

人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用.方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变.qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况.结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化.     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.