重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA 转染胰腺癌细胞BxPC-3及其沉默效应的研究

目的 研究重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA转染胰腺癌细胞BxPC-3及其沉默效应.方法 用重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA转染BxPC-3胰腺癌细胞作为研究对象.实验分5组.T1组:pSilencer4.1CMV neo-hTERT1-siRNA;T2组:pSilencer4.1CMV neo-hTERT2-siRNA;Lipofectamine组:Lipofectamine;错配组:pSilence4.1CMV,作为阴性对照:细胞对照组:未做转染的细胞.RT-PCR检测hTERT基因表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,Western blot检测细胞端粒酶蛋白表达.结果 与Lipofectamine组、阴性对照组及细胞对照组相比.T1组、T2组BxPC-3细胞中hTERT-mRNA和端粒酶蛋白的表达水平显著下降(P＜0.05).BxPC-3细胞活力明显降低(P＜0.05),G0/G1期细胞比例增高,S期和G2/M期细胞比例降低,细胞凋亡比例显著增加.结论 重组质粒T1和T2能够下调hTERT mRNA和端粒酶蛋白的表达水平,具有良好的RNAi沉默效应.重组质粒T1和T2均明显抑制BxPC-3胰腺癌细胞的生长,使细胞周期发生阻滞,促进细胞凋亡,具有一定的体外抗胰腺癌作用.     

丁酸钠对HepG2细胞诱导凋亡的作用及机制

目的探讨丁酸钠（sodium butyrate，SB）对HepG2细胞的诱导凋亡作用及与端粒酶活性的关系。方法采用MTT法检测5mmol／L丁酸钠在不同时间对HepG2细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测丁酸钠作用于HepG2细胞后的凋亡情况，及细胞周期的改变；TRAP-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果丁酸钠能明显抑制HepG2细胞增殖，并且这种抑制作用具有时间依赖性。丁酸钠处理HepG2细胞48h凋亡率明显提高（P〈0．01），S期细胞比例显著下降（P〈0．05），G0／G1期细胞比例显著升高（P〈0．05）。实验组端粒酶活性为1.16±0．12，对照组端粒酶活性为3．58±0．33，实验组端粒酶活性明显降低（P〈0．05）。结论丁酸钠具有诱导HeoG2细胞凋亡的作用，其机制与抑制端粒酶活性有关。     

瑞芬太尼对胰腺癌BxPC-3细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的观察瑞芬太尼对胰腺癌BxPC-3细胞增殖、凋亡的影响并探讨其作用机制。方法在体外培养BxPC-3细胞,用不同浓度瑞芬太尼(终浓度0、0.5、1、2、4、8 mg/mL)分别处理24、48、72 h,采用CCK-8比色法检测药物处理后细胞活力;瑞芬太尼(0、1、2、4 mg/mL)处理BxPC-3细胞48 h后,采用PI/Annexin V双染法检测细胞凋亡率;采用Western blot法检测药物对细胞Bax、Bcl-2、t-Akt、p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达的影响;采用端粒酶重复序列扩增法检测端粒酶活性。结果 CCK-8比色法结果显示,瑞芬太尼处理后可抑制BxPC-3细胞的增殖,且呈剂量、时间依赖性;瑞芬太尼处理后,PI/Annexin V双染后流式细胞仪检测结果显示,随着药物浓度的增加,BxPC-3细胞凋亡率也逐渐增加(P0.05);Western blot结果显示,随着药物浓度的增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低,且促凋亡蛋白Bax的表达量逐渐增高,BxPC-3细胞Akt总量未发生变化,而p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β的表达逐渐降低(P0.05);端粒酶重复序列扩增法检测结果显示,随着瑞芬太尼浓度的增加,BxPC-3细胞端粒酶活性降低(P0.05)。结论瑞芬太尼在体外能抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖并促进其凋亡,其作用机制可能与抑制Akt通路,上调Bax表达量,降低Bcl-2表达量,进而减弱端粒酶活性有关。     

端粒在As2O3致L02和HepG2细胞凋亡及染色体畸变中的作用

目的 探索端粒、端粒酶活性及端粒逆转录酶基因表达在As2O3诱导L02和HepG2细胞凋亡及染色体畸变过程中的作用.方法 12μmol/L As2O3处理L02和HepG2细胞24、48、72 h,以处理0h作为对照组,流式细胞仪检测细胞凋亡;应用以PCR为基础的端粒重复序列扩增(TRAP-PCR)银染法检测端粒酶活性;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测端粒逆转录酶(hTERT)mRNA表达;0.625 μmol/LAs2O3处理L02和HepG2细胞2、4、6周,以处理0周作为对照组,染色体核型分析检测细胞染色体畸变;检测端粒酶活性及端粒逆转录(hTERT)mRNA表达.结果 12 μmol/L As2O3处理L02和HepG2细胞凋亡率较对照组增加(P＜0.05);端粒酶活性及hTERTmRNA的表达较对照组均明显下降(P＜0.05).0.625 μmol/L As2O3处理L02和HepG2细胞,染色体端-端融合及双微体的畸变率较对照组增加(P＜0.05);端粒酶活性及hTERTmRNA的表达增加(P＜0.05).结论 高浓度As2O3短期处理L02和HepG2细胞可诱导其凋亡.而低浓度As2O3长期处理L02和HepG2细胞可导致染色体畸变,畸变可使基因组不稳定是细胞癌变的基础.端粒、端粒活性及hTERTmRNA表达在此过程中的不同变化也许可部分解释As2O3抗癌和致癌的矛盾作用.     

三氧化二砷诱导人卵巢癌细胞凋亡对端粒酶活性的影响

目的 探讨As2O3诱导细胞凋亡时对其端粒酶活性的影响及其作用机制.方法 采用光镜、电镜,PCRELISA,RT-PCR等技术,检测细胞凋亡,端粒酶活性及其催化亚单位的表达.结果 As2O3可诱导卵巢癌细胞凋亡,但存在作用浓度,细胞株类型差异性;端粒酶活性随药物作用时间和浓度的增加而明显减弱,同时伴随hTERT mRNA表达水平的下降.结论 端粒酶活性和hTERT mRNA表达在As2O3诱导SKOV3、3AO细胞凋亡过程中共同发挥作用,两者有密切关系,是诱导细胞凋亡的分子机制之一.     

转录因子Sp1和Sp3对Jurkat T细胞端粒酶活性的调节作用

目的探讨转录因子Sp1、Sp3对JurkatT细胞端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)的调节作用.方法用脂质体将Sp1、Sp3表达载体转入Jurkat T细胞,用Westem blotting方法检测蛋白表达水平;用端粒酶PCR-ELSA法检测细胞端粒酶活性并用银染显示端粒酶活性梯度;用RT-PCR方法检测hTERTmRNA水平.结果Sp1、Sp3载体转化36 h的细胞Sp1、Sp3蛋白水平分别升高59.6%(P〈0.01)和36.8%(P〈0.05);随着Sp1表达水平的增加,端粒酶活性和hTERT mRNA水平明显增加,增加率分别为38.5%(P〈0.05)和25.4%(P〈0.05).而Sp3表达载体对端粒酶活性和hTERT mRNA水平无明显影响.结论转录因子Sp1通过调节hTERT mRNA转录水平而调节Jurkat T细胞端粒酶活性,Sp3无此作用.     

鞘鞍醇激酶-1对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨鞘鞍醇激酶-1(SPK1)对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响.方法 培养的胰腺癌SW1990细胞株,实验分为DMS组、PMA组和对照组,各组细胞接种于孔板中,每组设3个复孔,每个实验至少重复3次.DMS组加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS,50μmol/L),PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,100 nmol/L),对照组按常规培养,采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR检测SPK1 mRNA的表达,Western blot检测SPK1蛋白的表达.结果 PMA组细胞的增殖活力[OD值:(1.37±0.03),细胞克隆数目:(292.45±10.68)]较对照组[OD:(1.00±0.01),细胞克隆数目:(215.34±12.23)]显著增加,DMS组细胞的增殖活力[OD值:(0.65±0.02),细胞克隆数目:(130.56±15.6)]较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).PMA组细胞凋亡率[(9.7±0.62)%]较对照组[(16.71±1.53)%]明显下降,DMS组细胞凋亡率[(31.7±1.32)%]较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01),PMA组SPK1 mRNA表达水平(0.202±0.013)及蛋白表达水平(0.258±0.015)较对照组[SPK1 mRNA:(0.148±0.006),蛋白:(0.182±0.044)]显著增加,而DMS组SPK1 mRNA表达水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表达水平(0.101±0.034)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关,SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡.     

丁酸钠对乳腺癌细胞增殖的影响

目的研究丁酸钠对乳腺癌细胞MDA-MB-435S增殖的影响。方法观察丁酸钠处理MDA-MB-435S细胞前后细胞生长速度、倍增时间、克隆形成率和细胞周期分布等变化,并进行统计学比较。结果与对照组相比,实验组生长速度明显减慢,倍增时间明显延长(P<0.01),且呈现浓度和时间依赖性。对照组细胞和实验组细胞克隆形成率分别为(75.00±5.67)%和(11.70±2.56)%,对照组高于实验组(P<0.01)。与对照组相比,实验组细胞出现明显的G1期阻滞(P<0.01),G2/M期细胞比例显著减少(P<0.01)。结论丁酸钠可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-435S的增殖。     

稳定表达Makorin环指蛋白1基因对人宫颈癌Siha细胞的影响

目的 研究稳定表达Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因对人宫颈癌细胞系Siha细胞的影响.方法 利用作者构建的稳定表达MKRN1基因的Siha细胞株,观察MKRN1基因对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录表达水平、端粒酶活性以及其对细胞周期的影响.结果 转染Siha细胞后,稳定表达MKRN1基因明显抑制细胞hTERT基因mRNA水平的表达,明显抑制细胞中端粒酶活性,并且G1期细胞明显增加,而S期细胞明显减少.结论 稳定表达MKRN1基因可特异性降低宫颈癌细胞中hTERT mRNA水平,抑制癌细胞内端粒酶活性,抑制宫颈癌细胞增殖,并且阻止宫颈癌细胞从G1期进入S期,促进细胞凋亡.     

重组质粒hTERT-siRNA对胰腺癌细胞移植瘤hTERT相关基因及蛋白表达的影响

目的探讨重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA对胰腺癌细胞BxPC-3裸鼠皮下移植瘤hTERT相关基因及蛋白表达的影响.方法建立人原发性胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为4组：（1）肿瘤对照组,未作任何处理;（2）空载组,即pSilencer4.1-CMV neo空质粒组;（3）T1组,即重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT1-siRNA组;（4）T2组,即重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT2-siRNA组）.荷瘤裸鼠分组处理30d后,RT-PCR检测各组瘤体中hTERT、Bcl-2、Bax mRNA的表达,免疫组织化学检测各组瘤体中Bcl-2、Bax、p53、VEGF、端粒酶蛋白表达,Western blot检测各组瘤体中端粒酶蛋白表达情况.结果 T1组和T2组hTERT和Bcl-2 mRNA表达较肿瘤对照组和空载组明显降低,BaxmRNA表达明显升高（P〈0.01）.与肿瘤对照组和空载组比较,T1组和T2组Bcl-2 Telomerase、p53和VEGF蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显升高（P〈0.01）.结论 （1）重组质粒T1和T2能够下调裸鼠移植瘤体内抗凋亡基因hTERT mRNA、Bcl-2 mRNA和蛋白、p53和端粒酶蛋白表达水平,上调促凋亡基因Bax mRNA和蛋白表达水平,其抗胰腺癌作用可能与促进胰腺癌细胞凋亡有关.（2）重组质粒T1和T2能够显著下调裸鼠移植瘤体内VEGF蛋白表达水平,可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。     

人端粒酶反转录酶反义寡核苷酸对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响

目的 通过体外实验探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)能否增强胰腺癌细胞对吉西他滨(健择)的敏感性.方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测hTERT mRNA表达情况;端粒重复序列扩增法(TRAP)、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法检测早期凋亡.结果 瞬时转染hTERT ASODN呈浓度依赖性下调细胞hTERT mRNA表达.0.2 μmol/L hTERT ASODN可显著下调端粒酶活性至0.47.健择在ASODN转染组中的IC50值为(0.8±0.2)μmol/L,而其在单纯脂质体转染对照组中为(7.3±0.9)μmol/L,差异具有统计学意义.ASODN可显著增加健择对肿瘤细胞的凋亡诱导作用,健择诱导的早期凋亡率在ASODN转染组中为60.28%,而其在脂质体对照组中为17.34%.结论 hTERTASODN可增强胰腺癌细胞对健择的敏感性,其机制可能与hTERT mRNA和端粒酶活性下调相关.     

丁酸钠对结肠上皮细胞凋亡的影响

目的:研究丁酸钠对正常和炎症结肠上皮细胞凋亡的影响及作用机制。方法:离体大鼠结肠黏膜固定于Ussing槽中孵育,黏膜面给予4%乙酸,并与正常结肠黏膜对照;在体实验,大鼠用醋酸诱导大鼠结肠炎。3 d后随机分为两组,每天分别给予丁酸钠、生理盐水灌肠1次。于第11天处死,取结肠组织进行TUNEL检测及免疫组化分析结肠上皮细胞凋亡情况。结果:①乙酸孵育无丁酸钠组离体结肠上皮细胞凋亡指数为25.37±2.38,乙酸孵育加丁酸钠组凋亡指数为10.58±1.77,P<0.05。正常黏膜无丁酸钠组结肠上皮凋亡指数为10.35±1.07,正常黏膜组加丁酸钠组结肠上皮凋亡指数为3.78±0.70,P<0.05。②丁酸钠灌肠治疗组平均凋亡指数2.35±0.41,凋亡指数和Bax表达水平明显低于对照组18.9±1.72,P<0.01。结论:似于体内肠腔正常浓度的丁酸钠(10 mmol/L)在体外体内对正常和炎症结肠上皮细胞有抑制其凋亡的作用。     

EGCG对前列腺癌细胞端粒酶的抑制作用及可能的机制

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞端粒酶的抑制作用及可能的作用机制。方法:用不同浓度的EGCG处理体外生长的人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,MTT法检测EGCG对PC-3细胞的抑制作用,TRAP-PCR银染法检测端粒酶活性以及荧光定量PCR法检测人端粒酶逆转录酶mRNA的表达。结果:与对照组相比,EGCG处理组可使存活率明显降低,并随药物剂量的增加呈下降趋势(P<0.01);TRAP-PCR银染法显示,EGCG能明显抑制人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞端粒酶的活性,并呈剂量依赖性(P<0.05);荧光定量PCR法显示,被EGCG作用的人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞端粒酶逆转录酶mRNA的表达呈下降趋势,并呈剂量依赖性。结论:EGCG可能通过抑制癌细胞的端粒酶的活性来抑制前列腺癌细胞的生长,对癌细胞端粒酶的抑制作用可能是通过抑制端粒酶的关键调节酶-端粒酶逆转录酶来实现的。     

非小细胞肺癌hTERT mRNA的定量表达及与COX-2基因的相关性

目的:探讨端粒酶hTERT mRNA定量表达在非小细胞肺癌发生中的意义,及其与COX-2基因的相关性,并探讨hTERT激活的可能调节机制。方法:应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测45例非小细胞肺癌组织及21例正常对照组的hTERT mRNA的定量表达水平,并用免疫组化方法检测其COX-2蛋白表达。结果:hTERT mRNA在非小细胞肺癌组织的表达量为2.854±0.728,显著高于正常肺组织2.042±0.378(t=-4.807,P<0.01)。相关分析显示,45例非小细胞肺癌中hTERT mRNA与COX-2蛋白表达水平呈正相关,相关系数(r=0.495,P<0.01)。结论:hTERT mRNA表达对非小细胞肺癌诊断具有潜在临床价值,hTERT的表达与COX-2表达存在显著相关性,支持COX-2的过度表达可能是端粒酶激活和调节的机制之一,选择性的应用COX-2抑制剂可能抑制非小细胞肺癌患者的端粒酶活性。