Fluo-3荧光微量法测定人红细胞胞浆内游离钙离子浓度

近年来研究表明,高血压病患者血管平滑肌功能异常主要与钙代谢有关,其中细胞内钙离子 (Ca2+ )浓度增加是导致血压升高的主要原因 [1]。血小板内游离钙测定已有较多报道 [2],在血小板的分离过程中易激活胞内花生四烯酸代谢,形成血栓烷A2 等物质,可促进血小板致密小管中储存钙的释放。而测定红细胞 (RBC)中游离钙,可较好地避免人为因素的影响。RBC胞浆钙 (RBCsCa2+ )测定方法有原子吸收光度法测定总钙量 [3],放射同位素 45Ca2+示踪法 [1],但操作繁锁,受条件限制。近来荧光钙结合探针Fluo 3的出现,可直接测定RBC内Ca2+浓度。避免血…     

检测红细胞胞浆内钙离子浓度的Fura-2荧光光度法

本文介绍使用荧光指示剂Fura-2直接定量测定大鼠红细胞胞浆内游离钙浓度的荧光光度法,并讨论了pH值及温度等因素对实验结果产生的影响。本法允许在细胞内游离钙浓度较低和红细胞数较少的条件下进行较为精确的荧光强度测定。为避免血小板对实验结果的影响,负载前要对红细胞进行纯化。但鉴于红细胞中血红蛋白的特征波长与Fura-2的波长相近,可抑制其特征荧光,因此Fura-2在应用中还存在一定的局限性。     

应用Fura 2－Am检测血小板胞浆游离钙浓度

本文以新型荧光指示剂Ｆｕｒａ２－Ａｍ检测血小板胞浆内游离钙浓度，并探讨检测过程中的某些实验条件。结果表明：正常成人，９５％参考值范围为１０７．８～１６７．４ｎｍｏｌ／Ｌ。批内及批间变异系数ＣＶ分别为４．６０％、６．２２％，重复性较好。且实验不受正常饮食、溶血、黄疸及高脂样品的干扰，证实此方法是一种较为简便可靠的检测血小板胞浆游离钙浓度的方法。     

检测红细胞胞浆内钙离子浓度的Fura—2荧光光度法

本文介绍使用荧光批示剂Ｆｕｒａ－２直接定量测定大鼠红细胞胞浆内游离钙浓度的荧光光度法，并讨论了Ｐｈ值及温度等因素对实验结果产生的影响。本法允许在细胞内游离钙浓度较低和红细胞数较少的条件下进行较为精确的荧光强度测定。     

用Fura 2－AM检测血小板胞浆游离钙浓度

本文对应用荧光指示剂Ｆｕｒａ２－ＡＭ（国产）测定血小板胞浆游离钙浓度的某些实验条件进行了探讨。结果表明：实验最适ｐＨ范围为７．３５～７．４５。实验不受溶血、黄疸及高脂血样品的干扰。批内ＣＶ４．９８％，批间ＣＶ５．６％。正常成人参考值为１６７．７５±２０．６６ｎｍｏｌ／Ｌ。与使用进口Ｆｕｒａ２－ＡＭ（Ｓｉｇｍａ产品）检测结果比较，结果无统计学差异，相关系数：γ＝０．９８。     

单纯性收缩期高血压患者心脏损害及其与细胞内胞浆游离钙的关系

目的：探讨细胞内胞浆游离钙在单纯性收缩期高血压（ISH）患者心脏损害中的作用。方法：检测ISH患者,原发性收缩期、舒张期均增记之“经典”高血压患者及血压正常者细胞内胞浆游离钙浓度（[Ca^2 ]i）,左心室重量指数（LVMI）及左心室收缩和功能。结果：ISH患乾和经典高血压患者均较血压正常者的[Ca^2 ]i和LVMI明显升高,左心室功能明显下降,收缩功能参无显著改变。ISH和经典高血压患者的[Ca^2 ]i与收缩压值和LVMI呈正相关。结论：ISH患者与经典高血压患者同样存在严重的钙代谢紊乱及心脏损害,其心脏损害和高血压的发生可能与钙代谢紊乱有关,可考虑用钙离子拮抗剂作为ISH的一线药物治疗。     

尖吻蝮蛇毒降压组分对血小板聚集及其胞浆游离钙浓度的影响

尖吻蝮蛇毒降压组分是从尖吻唤蛇毒中分离出来的具有扩张微小血管、降低血压作用的组分[1]。为了探讨其降压作用的机制，我们采用比浊法和Fura－2荧光测定法，探讨了其对人和兔血小板聚集及人血小板胞浆游离钙离子浓度的影响。材料和方法1材料降压组分（depressorcompoment，DPC）由本所提供；ADP、N，N一羟乙基哌嗪乙烷磺酸（HEPES）、刚跌美辛、前列腺素E；（PGE；）、Fura－2／AM、血小板活化因子（PAF）、钙离子载体人。ls，为Sigma公司产品；EG－TA为Fluka公司产品；TritonX－100为Room－Mass公司产品。2血小板聚集试验…     

微量法测定红细胞内游离原卟啉

有关红细胞内游离原卟啉(EPP)的测定方法很多,但大多步骤复杂、费时、用血量多,我们基本上参照上海劳动卫生职业病研究所有关资料(第四届华东地区劳动卫生与职业病学术交流资料),利用国产930荧光光度计(上海分析仪器三厂产品)测定微量血     

黄芪对慢性阻塞性肺疾病患者脂多糖引起游离钙浓度变化的影响

目的:观察黄芪对慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydis-ease,COPD)患者肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage,AM)胞浆游离钙浓度及其生成的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丙二醛的影响。方法:COPD组:选自1996-05/11山西医科大学第二医院呼吸科门诊患者13例,其中男7例,女6例。纳入标准:均符合2002年8月中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病诊治指南诊断标准,COPD分级为0级。排除标准:排除COPD分级为1～4级的患者。对照组:为本院门诊具有健康肺的患者13例,男8例,女5例。采用支气管肺泡灌洗、细胞培养和荧光指示剂方法,测定AM内钙浓度其生成的TNF-α和丙二醛。结果:①COPD患者AM内钙浓度(68.26±7.24)nmmol/L,TNF-α(5.74±0.42)μg/L、丙二醛(3.77±0.61)μg/L(每升1×109个AM细胞数分泌的TNF-α,丙二醛μg值)均较对照组胞内钙浓度(60.61±6.26)nmmol/L,TNF-α,丙二醛(2.06±0.20),(1.909±0.19)μg/L高(P<0.01)。②脂多糖刺激以后,胞内游离钙浓度,TNF-α,丙二醛均较刺激前增高(P<0.01)。③先加黄芪孵育AM再加入脂多糖,胞浆内游离钙浓度,TNF-α和丙二醛较仅加脂多糖时减少(P<0.01)。结论:黄芪可抑制脂多糖引起的游离钙浓度增加,对脂多糖刺激的TNF-α和丙二醛升高也有抑制作用;黄芪可调节肺泡巨噬细胞激     

哮喘患儿淋巴细胞胞浆游离钙离子浓度变化及其与呼吸爆发功能的关系

目的：研究哮喘患儿淋巴细胞胞浆游离钙离子浓度变化及其与呼吸爆发功能的关系。方法：采用Ｑｕｉｎ２荧光技术直接测定淋巴细胞胞浆游离钙离子〔Ｃａ２＋〕ｉ和细胞色素Ｃ还原法测定淋巴细胞呼吸爆发Ｏ÷２释放量。结果：淋巴细胞胞浆〔Ｃａ２＋〕ｉ哮喘发作期明显高于稳定期（Ｐ＜０．０１），稳定期与正常儿童相近（Ｐ＞０．０５），内、外源型哮喘间无显著性差异；淋巴细胞呼吸爆发释放Ｏ÷２量哮喘发作期明显高于稳定期（Ｐ＜０．０１），稳定期仍高于正常儿童（Ｐ＜０．０５），内、外源型哮喘间无显著性差异；相关分析显示哮喘患儿淋巴细胞胞浆〔Ｃａ２＋〕ｉ与其呼吸爆发Ｏ÷２释放量呈正相关关系（ｒ＝０．４１，Ｐ＜０．０５）。结论：哮喘患儿淋巴细胞呼吸爆发功能增强，其Ｏ÷２释放量的增加在哮喘气道炎症中起重要作用，淋巴细胞胞浆〔Ｃａ２＋〕ｉ的增高与其活化有一定关系，但钙拮抗剂不宜作为哮喘治疗的主要药物。     

脑血栓形成急性期患者血小板静息及激活状态胞浆游离钙离子浓度钙调素含量的实验研究

目的探讨血小板静息状态胞浆游离钙离子浓度([Ca2 ]i)、激活状态胞浆游离钙离子浓度([Ca2 ]ic)、钙调素含量 (CaM)在脑血栓形成(CT)急性期的变化及其作用。方法应用Fura-2荧光标记示踪法及酶联免疫法(ELISA)测定了31例CT急性期患者血小板[Ca2 ]i、[Ca2 ]ic浓度和CaM含量。结果脑血栓形成急性期患者血小板[Ca2 ]i、[Ca2 ]ic、CaM含量分别为(152．25 ±30．57)nmol／L,(200．36±33．62)nmol／L,(441．67±209．31)fg／102个血小板;正常对照组含量分别为(111．31±21．85)nmol／L, (158．43±22．44)nmol／L,(301．88 ±218．10)fg／102个血小板,脑血栓形成急性期患者血小板[Ca2 ]i、[Ca2 ]ic、CaM含量均明显高于正常对照(P<0．01,P<0．05)。结论脑血栓形成急性期患者,应用钙拮抗剂降低血小板胞浆钙离子浓度,可抑制血小板功能。     

实时荧光定量测定人B细胞激活因子受体基因表达水平

目的研究建立实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测人B细胞激活因子受体(BAFF-R)含量的方法，及探讨其在外周血单个核细胞(PBMC)中BAFF-R mRNA表达的检测价值。方法在BAFF-R基因高保守区设计特异性引物和荧光探针，用逆转录(RT -PCR)扩增目的片段实时检测产物的荧光强度，根据标准品建立标准曲线，由软件自动计算出待测样本中BAFF-R mRNA含量，并以BAFF-R mRNA和β2M mRNA含量的比值进行BAFF-R表达水平评价。结果RFQ-PCR检测BAFF-R含量的线性范围为10^9～10^1pg／ml，低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为12．5％和11．9％，高浓度样本批内和批间CV分别为8．3％和9．3％。30名健康献血员样本的PBMC中，83％(25／30)有BAFF-R mRNA表达，范围为0．14～1．03。结论RFQ-PCR检测BAFF-R mRNA含量的方法，具有较好的检测灵敏度和重复性。     

荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞体内示踪方法

背景:利用荧光染料标记活细胞体内示踪的方法较多,但是应用荧光染料浓度差异实现不同细胞体内示踪的方法目前仍不成熟.目的:观察不同浓度荧光活性染料CFSE标记的小鼠脾细胞体内示踪情况,建立稳定的单染料差异浓度标记活细胞的体内示踪方法.方法:取C57BL/6J及BALB/c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度CFSE染色后制备1:1混合细胞悬液;锥虫蓝染色鉴定细胞活性:将染色的混合细胞输注BALB/c小鼠后不同时间点,流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例.结果与结论:CFSE标记的小鼠脾细胞活力良好,荧光显微镜下见全部细胞标记后均发绿色荧光,形态正常,CFSE标记阳性率为95%.CFSE染色时,在浓度相差20倍时流式直方图才显示为两个完全独立的峰,即CFSE低浓度用0.3 μmol/L,高浓度用6 μmol/L.异基因的C57BL/6J脾细胞在输注1 d后就快速消失,而同基因BALB/c脾细胞能够在BALB/c小鼠外周血中长期存在,但是两种细胞荧光强度均未见降低,说明荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞进行体内示踪是一种稳定的示踪方法.     

高原红细胞增多症患者红细胞膜成分及红细胞内离子浓度的变化

我们测定高原红细胞增多症（ＨＡＰＣ）患者红细胞膜脂质,膜三磷酸腺苷酶及红细胞内离子浓度,以了解ＨＡＰＣ患者红细胞成分及离子转运功能变化。现报告如下。对象和方法１研究对象１．１实验组：根据中华医学会第２次全国高原医学学术讲座会拟定的诊断标准［１］。ＨＡ...     

双探针实时荧光定量检测HCV RNA的研究

目的建立双探针荧光定量HCV RNA检测方法,探讨解决HCV RNA定量灵敏度和特异性问题。方法对89例抗HCV抗体阳性和220例阴性样本用双探针荧光定量法和两种商品荧光定量试剂方法进行检测。结果双探针荧光定量法阳性率分别为91.0%(81例)和2.72%(6例)。两种商品荧光定量试剂方法阳性率分别为82.0%(73例)和0.9%(2例);79.7%(71例)和2.27%(5例)。结论双探针荧光定量提高了HCV RNA检测的灵敏度和特异性。     

PCR-荧光探针法检测分枝杆菌的临床应用价值

目的 比较PCR-荧光探针法和改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的一致性,探讨两种方法在临床上的应用价值.方法 应用PCR-荧光探针法检测69例改良罗氏培养阳性的分枝杆菌核酸,比较两种方法检测结果的一致率;两种方法检测结果不一致样本进行测序验证,以测序结果作为金标准,分析两种方法检测结果的正确率及不一致的可能原因.结果 两种方法检测总一致率为89.9%,结核分枝杆菌检测一致率为87.5%,非结核分枝杆菌检测一致率为90.6%.PCR-荧光探针法和改良罗氏培养法共有7例检测结果不一致,与测序结果比对后,改良罗氏培养法检测的正确率为94.2%,PCR-荧光探针法检测的正确率为92.8%.结论 操作简单、快速,灵敏的PCR-荧光探针法与作为传统金标准的改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的一致性良好、正确率高,可作为临床分枝杆菌感染诊断的重要检测手段.     

抗晚期糖基化终产物受体抗体对晚期糖基化终产物引起心肌细胞胞内游离钙瞬变的影响

目的:观察抗晚期糖基化终产物受体(RAGE)抗体对晚期糖基化终产物刺激引起的体外培养乳鼠心肌细胞胞游离钙瞬间升高的影响。方法:实验于2004-07/12在南方医科大学基础部中心实验室及南方医科大学心血管内科实验室进行。①取新生1-3dSD大鼠心脏在Petridish培养皿中行原代心肌细胞培养。②培养3-5d的原代心肌细胞分为2大组,第1大组:人血清白蛋白组、AGEs-HSA组、抗RAGE抗体10,50mg/L组;第2大组:人血清白蛋白组、AGEs-HSA组、丙种球蛋白10,50mg/L组。处理组试验前用相应浓度抗体提前预孵2h。③将处理好的细胞用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM标记后,于激光共聚焦显微镜下观察刺激后细胞内游离钙浓度(以荧光值表示)变化。人血清白蛋白组给予人血清白蛋白200mg/L刺激,其他各组给予晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白200mg/L刺激。结果:①第1大组组间比较:AGEs-HSA组细胞荧光峰值和荧光值升高幅度均高于人血清白蛋白组[147.47±21.72,98.66±28.51;(78.47±22.94)%,(26.93±6.72)%;P均<0.05],抗RAGE抗体10,50mg/L组细胞荧光峰值和荧光值升高幅度均小于AGEs-HSA组[68.48±20.94,59.78±5.95;(-33.21±21.57)%,(1.80±7.00)%;P均<0.05]。②第2大组组间比较:AGEs-HSA组和丙种球蛋白10,50mg/L组细胞荧光峰值均高于人血清白蛋白组(61.72±28.62,59.60±17.20,39.04±5.62,P<0.05),后3组间比较无差异。结论:抗RAGE抗体可以阻断晚期糖基化终产物引起的心肌细胞胞内游离钙离子浓度升高,提示晚期糖基化终产物引起心肌细胞胞内游离钙离子浓度升高是由RAGE介导的。     

实时荧光定量PCR检测人胰岛素样生长因子及其受体基因的方法学构建

目的建立检测人胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、IGF-1受体(IGF-1R)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)及IGF-2受体(IGF-2R)基因的实时荧光定量PCR。方法设计并合成检测上述4种基因的引物及TaqMan探针;提取胎盘组织RNA并逆转录为cDNA,分别将扩增的4种基因片段纯化后与质粒载体连接,克隆构建含目的基因片段的重组质粒,分别作为定量检测上述4种基因的标准品;用建立的实时荧光定量PCR检测上述4种基因,并用测序验证。结果 PCR扩增产物经测序分析证实分别为上述4种基因的特异性片段;定量检测IGF-1、IGF-1R、IGF-2及IGF-2R的线性范围分别为1.00×102~1.00×108copies/μL、2.00×102~2.00×108copies/μL、3.00×102~3.00×108copies/μL及5.00×102~5.00×108copies/μL;相关系数(r)分别为0.994、0.993、0.995及0.996;扩增效率分别为92.35%、96.06%、94.92%及98.84%;批间变异系数(CV)分别为1.64%~2.83%、1.73%~1.98%、2.47%~4.09%及2.25%~2.52%;批内CV分别为1.36%、1.02%、1.04%及0.96%。结论建立了高度敏感、特异检测人IGF及其受体的实时荧光定量PCR法。     

荧光探针定量PCR检测HBV-DNA

本文采用荧光探针定量(FQ-PCR)法准确定量检测HBV-M阳性标本中的HBV-DNA数量.结果显示:HBeAg(+)组(32份)的阳性率为100%,HBV-DNA拷贝数范围在105～109/ml之间.HBeAb(+)组(47份)的阳性率为23.4%,HBV-DNA拷贝数范围在103～105.7/ml之间;HBsAb(+)组(37份)的阳性率为2.7%,HBV-DNA拷贝数为105/ml.以上44例HBV-DNA阳性拷贝数范围在103～109/ml之间.HBeAg(+)组血清中HBV-DNA含量(107.09±1显著高于HBeAb(+)组(104.7±1)和HBsAb(+)组(105).结果表明:HBV-DNA的FQ-PCR检测较常规PCR更具有较高的灵敏度和特异性,且定量准确,结果可靠,能避免PCR后处理污染导致的假阳性,可反映HBV真实感染和低复制状态.结合HBV-DNA含量测定判断HBV病毒复制状态,对临床诊断、治疗及判断预后具有重要的指导意义.