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1.
目的:获取多囊蛋白-1胞内区片段。方法:用PCR法克隆多囊蛋白-1胞内区的cDNA片段,然后插入融合蛋白表达载体pProEXHta中,经测序证实后,转入大肠杆菌中表达并用亲和层析法进行纯化。结果:克隆到一个660bp的多囊蛋白-1胞内区cDNA片段,得到了一个相对分子质量为2.6万的融合蛋白。结论:多囊蛋白-1胞内区片段的融合蛋白为制备抗多囊蛋白-1单克隆抗体提供了基础。 相似文献
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多囊蛋白1表达载体的构建及表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:体我表达并纯化多囊蛋白1胞外区片段。方法:提取健康人肾组织总RNA,用一步法RT-PCR选择扩增编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的2个cDNA片段,并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE30中,转染含有阻遏质粒pREP4的大肠杆菌M15。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。结果:克隆到2个编码多囊蛋白1胞外区的cDNA片段,其大小分别为502bp和471bp。构建的表达质粒pQE30-PKD1el和pQE-30-PKDle2经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为19800,189000的融合蛋白,经蛋白质印迹分析鉴定为多囊蛋白1的融合蛋白。结论:本实验克服了PKD1基因在体内多个同源序列的干扰,克隆了编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的cDNA序列,并成功地获得了融合表达的目的蛋白,为进一步制备抗多囊蛋白1胞外区的抗体创造了条件。 相似文献
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目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。 相似文献
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抗AIB1-N单克隆抗体的制备及鉴定 总被引:4,自引:0,他引:4
目的获得有生物活性的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端(amplified in brest cancer 1-Nterminal,AIB1-N)单克隆抗体。方法以谷胱甘肽转硫酶耦联的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端蛋白(GST-AIB1-N)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗AIBl一N单克隆抗体,用间接ELISA和Western-blot鉴定其亚类和抗原结合特异性。结果成功筛选出一株稳定分泌抗AIB2—N单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类为IgG1,经Western-blot鉴定该McAb特异性高,亲和力强。结论成功制备了抗AIB1-N单克隆抗体,为深入研究AIB1的表达及临床应用提供了有力的工具。 相似文献
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目的 制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1~4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础.方法 应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1~4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法.结果 从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母(Pichia Pastoris-NS1)中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,最终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8 000~1∶16 000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1~4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法.结论 成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.初步建立了可检测1~4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法. 相似文献
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目的:制备抗-戊型肝炎病毒的单克隆抗体,并将其用于分析戊型肝炎病毒不同毒株结构蛋白的抗原表位。方法:采用来自墨西哥株(Mexican strain)的戊型肝炎病毒重组蛋白(p166Mex)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选阳性克隆,并将获得的单克隆抗体与戊型肝炎病毒缅甸株(Burma strain)和美国株(USA strain)的重组蛋白(p166Bur,p166US)进行交叉反应测定。结果:最终获得4株能稳定分泌抗-p166Mex的杂交瘤细胞株。即D8G10,E5E12,D4A3,B7E6。其中D8G10,E5E12和B7E6细胞株的培养上清液,还能分别与p166Bur和p166US重组蛋白发生阳性反应。结论:利用已获得的抗-p166Mex单克隆抗体,初步确定3种不同的戊型肝炎病毒重组蛋白(p166Bur,p166US,p166Mex)含有一种共同的抗原表位。 相似文献
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目的:制备周围神经43kD蛋白单克隆抗体。方法:通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统,从周围神经组织中分离回收43kD蛋白作为抗原,免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术,点膜印迹法检测,获得相应的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以Western blot方法检测抗体的特异性。结果:阳性克隆可持续稳定分泌抗43kD蛋白抗体,Western Blot显示在43kD处出现特异的阳性反应条带。结论:建立了分泌抗43kD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得了43kD蛋白单克隆抗体。 相似文献
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目的 建立通过单次细胞融合制备抗复合抗原(多种抗原)单克隆抗体的方法。方法 用复合抗原(甲胎蛋白、癌胚抗原、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎e抗原)免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过Protein-G亲和层析纯化阳性杂交瘤细胞株腹水,并通过亚类试剂盒法和非竞争ELISA法分别测定抗体亚类和亲和常数,同时应用免疫印迹分析其特异性。结果 通过单次细胞融合共获得20株抗上述复合抗原的单克隆抗体,其中针对甲胎蛋白的单克隆抗体5株、针对癌胚抗原的单克隆抗体6株、针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体3株;针对乙型肝炎核心抗原的单克隆抗体4株、针对乙型肝炎e抗原的单克隆抗体3株。已鉴定的部分阳性杂交瘤细胞株亚类均为IgG1,抗体亲和常数介于1×109M-1~2.8×1011M-1,免疫印迹分析显示,所获得的单抗都与其抗原发生特异性结合。结论 建立了通过单次细胞融合制备针对复合抗原的单克隆抗体制备技术,使单克隆抗体的产出率显著提高,制备周期明显缩短,为建立规模化单克隆抗体制备平台奠定基础。 相似文献
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抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备与鉴定 总被引:5,自引:0,他引:5
目的制备抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)全菌的单克隆抗体并对其特异性进行初步鉴定。方法用培养的幽门螺杆菌超声破菌后的上清和沉淀为抗原分别免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体并测定抗体免疫球蛋白亚类、效价及亲和力,用重组表达的Hp Lpp20、HspA、urease A、CagA、urease B、catalase蛋白鉴定抗体。结果共获得34株抗Hp的单克隆抗体,其中抗上清31株和抗沉淀3株,34株抗体中针对Lpp20、HspA、urease A、CagA、urease B、catalase蛋白的抗体分别为3、2、4、1、5、2株,目前已鉴定的部分单克隆抗体的亚类均为IgGl,细胞培养上清的效价为1:16-1:32,腹水效价为1:32000~1:64000,抗体亲和常数介于1×10-10mol/L-5.2×10-12mol/L。结论获得特异性针对幽门螺杆菌的单克隆抗体,为幽门螺杆菌的诊断和疫苗研究奠定基础。 相似文献
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肝癌单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:获取抗人原发性肝癌单克隆抗体重、轻链可变区基因。方法:从分泌高亲和力的抗人原发性肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM8.11中提取细胞的总RNA,以随机引物反转录合成cDNA,以特异引物进行PCR,扩增了单抗的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因,并进行了序列分析。结果:VH基因片段长度为351bp,编码117个氨基酸残基;VL基因片段长度为324bp,编码107个氨基酸残基。两者均有4个 相似文献
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Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性血清型单克隆抗体的制备及鉴定 总被引:5,自引:1,他引:5
目的研制Ⅰ型登革病毒(DEN1)非结构蛋白1(NS1)蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其特异性。方法以具有良好免疫原性的DEN1重组NS1蛋白、DEN1全病毒及两者混合免疫共3种免疫方案,分别免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法双筛I、FA和Western Blot进行mAbs的类型及亚类、特异性等鉴定。结果采用3种免疫方案免疫Balb/c小鼠,获得9株抗NS1蛋白的mAb,其亚类测定一株为IgG2a,另外8株为IgG1。这些mAbs与DEN1重组NS1蛋白和DEN1全病毒均结合,而且特异性好,仅1株杂交瘤分泌的单抗和其余3型DEN有交叉反应。结论成功获得了特异性针对DEN病毒NS1蛋白的特异性血清型mAb,将为进一步研究NS1蛋白的结构和功能及临床诊断试剂研发奠定基础。 相似文献
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抗人MIF单克隆抗体的制备及其活性的初步鉴定 总被引:1,自引:1,他引:0
目的构建人巨噬细胞移动抑制因子(human macrophage migrationinhibitoryfactor,hMIF)原核表达系统并制备其单克隆抗体.方法采用RT-PCR从乳腺癌细胞株MDA-MB453细胞克隆hMIF cDNA,测序后构建pET11b/hMIF重组表达质粒,转化入大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达hMIF;重组hMIF经纯化和鉴定后,作为抗原常规免疫和CpG ODN加强免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体并鉴定活性.结果构建pET11b/hMIF重组表达质粒,表达出预期hMIF蛋白,表达率30%,纯化后纯度达95%.Western blotting鉴定为hMIF,NO释放实验证实具有生物学活性.两种免疫方案共获得9株分泌抗hMIF抗体的杂交瘤细胞株,其中一株经Western blotting和活性鉴定证明具有特异性和生物学活性.结论获得hMIF重组蛋白和抗hMIF单克隆抗体,为其基础性研究和在脓毒症的治疗等临床应用研究奠定基础. 相似文献
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目的研制间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)单克隆抗体,并对抗体特性进行了初步鉴定。方法用纯化的重组PvLDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,测定其免疫球蛋白亚类及效价,结合ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果共获得5株稳定分泌抗PvLDH重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为6D1、6D2、5A10、5C7、4A8。5株单抗培养上清的ELISA效价为1∶512~1∶1024,腹水效价为1∶12800~1∶25600,其中5C7、6D1经Western-blot鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应。结论本研究方法成功制备并获得了针对PvLDH的单克隆抗体,为进一步研究疟疾诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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目的:制备人纤维连接蛋白(fibronectin,FN)羧基端细胞结合域的单克隆抗体,并以该抗体检测心脏瓣膜基质蛋白中FN蛋白的表达情况.方法:用RT-PCR方法获取人FN羧基端细胞结合域基因序列,通过pET32质粒表达获得TRX融合蛋白.并以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠后,按常规方法制备成单克隆抗体,获得分泌抗FN单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果:蛋白电泳结果显示,所获TRX融合蛋白条带与理论计算值相符,免疫动物后获得2株分泌抗FN羧基端细胞结合域不同位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型为IgG2a,免疫组化显示该抗体能特异性地结合人心脏瓣膜基质中的FN.结论:成功制备了分泌抗FN单克隆抗体,为FN结构、功能和机制的研究提供了有效工具. 相似文献
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目的制备抗恶性疟原虫EBA—175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法以恶性疟原虫EBA-175(Ⅱ区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株.测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4Al、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800-1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb 1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Western blot试验中识别恶性疟原虫Mr约35000的虫源蛋白。结论获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。 相似文献