Duchenne型肌营养不良症模型小鼠神经肌肉接头特征研究

目的观察Duchenne型肌营养不良症模型小鼠骨骼肌肌膜抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达变化和神经肌肉接头形态,分析其可能机制。方法 C57BL/6和mdx小鼠各8只,HE染色观察肌细胞组织学形态,免疫荧光染色检测腓肠肌肌膜dystrophin蛋白表达变化和神经肌肉接头形态。结果C57BL/6小鼠腓肠肌肌细胞大小基本一致,呈多角形,胞核位于细胞周边、极少数位于肌纤维中心;肌膜均匀表达dystrophin蛋白;神经肌肉接头形态完好。Mdx小鼠腓肠肌肌细胞大小不一致,呈圆形,部分胞核趋中心化;仅少量或个别肌细胞表达dystrophin蛋白;mdx种鼠突触后膜乙酰胆碱受体断裂成小片段,突触前膜神经末梢突起增多、变细,而mdx幼鼠神经肌肉接头形态与C57BL/6小鼠基本一致;mdx小鼠神经肌肉接头数目明显减少,突触前膜和突触后膜横截面积明显减小,肌细胞间神经轴突明显变细。结论Mdx小鼠骨骼肌肌膜dystrophin蛋白缺失并非导致神经肌肉接头改变的直接因素,可能与病情进展有关。     

肌营养不良症模型鼠骨骼肌的组织病理学研究

目的　比较肌营养不良症模型 (mdx)鼠、C57鼠和Duchenne型肌营养不良症 (DMD)患者骨骼肌的组织病理学改变 ,以及dystrophin在肌细胞膜上的分布。方法　取mdx鼠、C57鼠和DMD患者骨骼肌作常规HE染色 ,比较其组织学改变 ;同时对mdx鼠、C57鼠骨骼肌作dystrophin的免疫组化染色 ,比较dystrophin在肌细胞膜上的分布。结果　mdx鼠骨骼肌肌纤维大小不等 ,轮廓变圆 ,肌间隙增宽 ,少量脂肪、结缔组织增生 ,细胞核中心移位增多 ,部分肌纤维变性坏死 ,而DMD患者骨骼肌的改变和mdx鼠基本一致。mdx鼠肌细胞膜缺乏完整环行棕色条带 ,而C57鼠则呈一完整环行棕色条带 ,提示mdx鼠dystrophin蛋白缺乏。结论　mdx鼠有类似于DMD患者的骨骼肌组织病理学改变     

重组腺相关病毒（rAAV）介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响

目的　 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx ,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。方法　以dystrophin小基因SMCK A3999为目的基因 ,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以 5× 10 10 病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,基因治疗后 4个月及 7个月 ,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法 ,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。 结果　rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dys trophin恢复并稳定表达持续 7个月以上 ,肌肉组织病理改变好转 ,肌病肌电图改变明显改善 ,疗效持续 4个月以上。 结论　rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能 ,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMC KA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗对Duchenne肌营养不良肌力的影响

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人dystrophin小基因SMCKA3999对DMD病理、肌力改变的治疗作用.方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌,基因治疗4月后免疫荧光法检测肌膜dystrophin基因表达,治疗5月后采用肌肉离体灌注电刺激测定腓肠肌肌力,观察rAAVSMCKA3999对mdx鼠肌力的疗效.结果rAAVSMCKA3999有效稳定表达并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善mdx鼠肌力.结论rAAVSMCKA3999对DMD治疗有效,能显著改善mdx鼠肌肉功能,应用重组腺相关病毒载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999是治疗DMD有希望的方法.     

mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达**

背景：干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低。 目的：通过比较mdx小鼠和C57小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx小鼠骨骼肌病理改变的可能机制。 方法：取mdx小鼠与C57小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx小鼠和C57小鼠骨骼肌组织总RNA,real-time PCR检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达。 结果与结论：mdx小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa染色可见钙结节沉积,而C57小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边。与C57小鼠比较,mdx小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调(P < 0.05),而成肌基因表达下调(P < 0.05)。dystrophin基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx小鼠肌肉组织变性坏死的原因。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗Duchenne肌营养不良小鼠的研究

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人抗肌萎缩蛋白(dystrophin)小基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良(DMD)在病理、肌电图、肌力方面的治疗作用。方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAV SMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠(mdx鼠)腓肠肌,基因治疗4个月后,以免疫荧光双标法检测肌膜dystrophin基因表达,采用Nicolet肌电及诱发电位仪记录mdx鼠肌电图,基因治疗5个月后以肌肉离体灌注电刺激法测定腓肠肌肌力,观察rAAV SMCKA3999对DMD动物模型鼠的治疗作用。结果rAAVSMCKA3999能有效稳定表达,并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善DMD肌电图表现,肌力恢复。结论rAAV SMCKA3999对mdx鼠治疗有效,能显著改善其肌肉功能,应用rAAV介导的dystrophin小基因SMCKA3999基因治疗是临床治疗DMD有希望的方法。     

杆状病毒修饰后的脂肪干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的利用经杆状病毒基因载体系统进行micro-dystrophin基因修饰后的脂肪干细胞(ADSCs)移植治疗Duchenne型肌营养不良症模型(mdx)鼠,探讨ADSCs移植治疗DMD的安全性及可行性。方法 Mdx鼠60只,分为mdx对照组(30只)和mdx移植组(30只);正常C57小鼠为C57对照组(30只)。体外分离培养小鼠ADSCs,利用杆状病毒基因载体进行micro-dystrophin基因修饰;将基因修饰后的ADSCs经尾静脉移植到mdx鼠体内。于移植后检测mdx鼠的运动功能(采用主动牵引实验和被动转棒实验)、血清CK水平、肌肉病理改变以及肌肉micro-dystrophin表达水平。结果经micro-dystrophin基因修饰的ADSCs移植后,能够重建mdx鼠的micro-dystrophin表达,一定程度上减轻并逆转肌肉的病理损害,进而降低血清CK水平,mdx鼠整体运动功能也有一定改善。结论 ADSCs治疗mdx鼠后,可部分重建模型鼠的dystrophin表达,改善肌肉的病理损害,表明ADSCs是有希望治愈DMD的方法之一。     

Duchenne肌营养不良模型鼠骨髓移植后dystrophin的表达

目的　观察Duchenne型肌营养不良模型鼠 (mdx鼠 )不同成分骨髓细胞移植后dystrophin的表达。方法　用体外培养的C57BL雄鼠的骨髓细胞、骨髓悬浮细胞、骨髓基质细胞分别经鼠尾静脉注射到放疗后的mdx鼠体内 ,动态观察受体雌性mdx鼠骨骼肌dystrophin的表达 ,并取受体mdx雌鼠血 ,用聚合酶链反应进行Sry基因检测。结果　骨髓细胞、悬浮细胞、基质细胞移植后 1～ 2个月 ,较少肌纤维表达dystrophin(<1 % ) ,3～ 4个月分别约有 7%、6 %、4 %的肌纤维表达dystrophin。Sry基因检测均扩增出受体雌鼠Y染色体上 449bp的DNA片段 ,提示供体细胞在受体内存活。结论　骨髓细胞、悬浮细胞、基质细胞分别移植到mdx鼠体内后 ,mdx鼠骨骼肌均有dystrophin的表达     

骨髓移植治疗Duchenne型肌营养不良症模型鼠后dystrophin相关蛋白表达

目的观察骨髓移植治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)模型鼠—mdx鼠后，β-dystroglycan和α-sarcoglycan在肌膜上的表达情况。方法以正常C57鼠作为供体，以mdx鼠作为受体进行骨髓移植，在移植后2、4、6个月分别进行mdx鼠骨骼肌的β-dystroglycan和α-sarcoglycan免疫荧光染色，计算阳性细胞的荧光积分光密度，与C57鼠及未移植的mdx鼠进行比较。结果在骨髓移植后2、4、6个月mdx鼠骨骼肌肌膜上β-dystroglycan和α-sarcoglycan的表达量均有随时间的延长逐渐增加的趋势．至移植后6个月时，二者的表达量明显高于未治疗的mdx鼠。结论骨髓移植可使mdx鼠的dystrophin相关蛋白在病损骨骼肌细胞膜上表达增加．其对维持肌膜的稳定性、促进肌肉的恢复有重要意义。     

Mdx小鼠骨骼肌纤维化及Spp1基因表达

目的通过观察Duchenne型肌营养不良的模型鼠mdx小鼠骨骼肌中纤维化情况,研究Spp1基因在mdx小鼠及其对照鼠中不同时期的表达,探讨在mdx小鼠中Spp1与肌纤维化的关系。方法选取雄性C57BL/10Sc Sn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,雄性C57BL/6Sc Sn小鼠为对照组,根据年龄分为2w组、4w组、8w组、12w组。每组选取6只,3只用于冰冻切片的苏木精-伊红染色及马松(masson)染色,3只用于基因芯片及q RT-PCR。结果 2w及4w时mdx小鼠无明显结缔组织增生,8w时,mdx小鼠可见轻度结缔组织增生;12w时,mdx小鼠结缔组织增生程度较8w稍加重,仍为小片状区域的纤维化,对照组小鼠不同时期均未见纤维化;mdx小鼠2w与12w股四头肌基因芯片表达谱对比,其中Spp1基因在mdx小鼠2w与12w相比fold-change值为-15.1354,变化明显;Spp1在mdx小鼠股四头肌不同时期表达量比较:8w组较4w组明显升高,12w组较8w组表达量下降,但仍高于4w组,8w组与12w组Spp1表达量较同期对照组明显升高,差异具有统计学意义。结论 mdx小鼠早期(2w~4w)肌纤维化表现不明显,8w时骨骼肌内可见少量结缔组织增生,随后缓慢进展。2 Spp1基因在mdx小鼠成熟期(8w~12w)表达量明显增加,推测其在mdx小鼠肌纤维化中发挥一定作用。