IGF-I和hCG对大鼠Leydig细胞葡萄糖转运蛋白基因表达调控研究

背景与目的:研究胰岛素样生长因子-I(Insulin-likegrowthfactor-I,IGF-I)和人绒毛膜促性腺激素(humanChorionicGonadotropin,hCG)对成年大鼠Leydig细胞中葡萄糖转运蛋白(Glucosetransporters,GLUTs)基因表达的影响,为进一步探讨Leydig细胞中睾酮的合成与葡萄糖代谢关系提供依据。材料与方法:采用改良的Klinefelter方法从成年大鼠睾丸中分离获得Leydig细胞,并用反转录-聚合酶链技术检测IGF-I和hCG对Leydig细胞中GLUTs基因表达的调控作用。结果:分离得到纯度为98%的Leydig细胞,与空白对照组相比,hCG可显著增加Leydig细胞中GLUT8基因mRNA的表达,并且此作用具有剂量依赖性与时效性。100ng/mlIGF-I可显著增加Leydig细胞中GLUT8基因mRNA表达,并且IGF-I可和hCG协同作用,显著提高GLUT8基因mRNA表达,该结果与100ng/mlIGF-I和10ng/mlhCG协同作用显著增加睾酮合成的结果相吻合。然而,在大鼠Leydig细胞中,无论是10ng/mlhCG或100ng/mlIGF-I单独作用或同时作用于细胞,都不影响GLUT1和GLUT3基因mRNA水平。结论:在成年大鼠Leydig细胞中,IGF-I和hCG对细胞中GLUT8基因表达的调节作用具有特异性,IGF-I和hCG能协同作用显著提高细胞GLUT8基因mRNA水平,从而增强细胞摄取葡萄糖的能力,可为细胞提供更多的代谢能源,最终增加了Leydig细胞睾酮合成与分泌。     

IP-10基因过量表达对MA-10小鼠Leydig肿瘤细胞类固醇合成及细胞增殖的影响

背景与目的:研究在体外培养的MA_10小鼠Leydig肿瘤细胞中,IP_10基因的过表达对细胞类固醇合成以及细胞增殖的影响作用。材料与方法:采用细胞转染实验,将含有IP_10基因cDNA的重组质粒转入MA_10小鼠Leydig肿瘤细胞中,用Westernblotting法检测细胞IP_10基因的过表达,用放免分析(Radioimmunoassay,RIA)方法检测IP_10基因过表达对MA_10细胞孕酮合成的影响,用3H_Thymidine掺入DNA合成实验研究IP_10基因过表达对MA_10细胞增殖的作用。结果:实验数据表明,成功地在MA_10细胞中过量表达了IP_10蛋白;MA_10细胞内转染的IP_10基因的过量表达可显著抑制8_bromo_cAMP(0.2mmol/L)诱导的孕酮生成,加入1.0μgIP_10重组质粒转染细胞时,可以使8_bromo_cAMP诱导的孕酮的合成水平由对照组的(38.5±1.7)ng/mL显著降低到(23.2±1.5)ng/ml(1.5×105cells/ml) ,且抑制作用随所用IP_10重组质粒的浓度增加而增加,它的抑制作用可能是通过减少了类固醇合成急性调节蛋白StAR基因的表达而达到的。3H_Thymidine掺入实验结果还显示,IP_10基因在转染的MA_10细胞中过量表达能够显著抑制MA_10细胞的增殖。结论:过量表达的IP_10基因对MA_10小鼠Leydig肿瘤细胞的类固醇合成及生长具有显著的抑制作用,此结果提示我们可以考虑使用转入IP_10基因的     

雷公藤内酯醇对淋巴瘤 Raji 细胞 ID4基因及 DNA 甲基转移酶表达的影响

目的：探讨雷公藤内酯醇（triptolide,TPL）对淋巴瘤 Raji 细胞 ID4基因及 DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMT）mRNA 表达的影响。方法：收集经0、20ng／ml TPL 处理的 Raji 细胞,采用荧光定量RT －PCR 法检测 Raji 细胞 ID4基因 mRNA 的表达。经0、5、10、15、20ng／ml TPL 处理的 Raji 细胞,采用荧光定量 RT －PCR 法检测 Raji 细胞 DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B mRNA 的表达。结果：未经 TPL 处理的 Raji 细胞ID4基因无表达,20ng／ml TPL 作用后 ID4基因表达增强。在0～20ng／ml 浓度范围内,随着 TPL 浓度的增加, DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B表达下降并呈浓度依赖性。结论：TPL 可抑制 Raji 细胞 DNA 甲基转移酶 mRNA,恢复 Raji 细胞 ID4基因 mRNA 表达。     

乌头碱对大鼠睾丸间质细胞的毒性研究

背景与目的： 研究乌头碱对原代培养的大鼠睾丸间质细胞(Leydig细胞)的毒性作用。 材料与方法： 采用性成熟雄性SD大鼠,分离大鼠睾丸间质细胞,通过Percoll不连续密度梯度离心进行细胞纯化,采用3β-羟类固醇脱氢酶染色进行细胞鉴定。实验分设不同浓度的乌头碱给药组(5×10、5×102、5×103、5×104 ng/ml)和溶剂对照组(DMSO),用MTT检测乌头碱对大鼠睾丸间质细胞活力的影响,并用丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测乌头碱对间质细胞脂质过氧化的影响以及采用睾酮放免试剂盒检测乌头碱对间质细胞睾酮分泌功能的影响。 结果： 乌头碱作用于大鼠睾丸间质细胞24 h和48 h时,各剂量组对大鼠睾丸间质细胞活力无明显影响,与溶剂对照组(DMSO)相比,差异无统计学意义(P>0.05);24 h时,乌头碱各剂量组对大鼠睾丸间质细胞的MDA含量和SOD活力无明显影响,与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);24 h时,乌头碱各剂量组对hCG诱导大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌无明显影响,与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： 5×10、5×102、5×103、5×104 ng/ml的乌头碱对大鼠Leydig细胞无明显毒性作用。     

逆转录PCR方法检测HoxA族基因在胶质瘤细胞C6中的表达

背景与目的：同源盒基因是生物发育调节的主控基因，具体作用体现在调控DNA的转录过程。近年来已发现多种恶性肿瘤中有不同种类的同源盒基因异常表达。胶质瘤中同源盒基因的表达尚未全部确定。本研究旨在观察胶质瘤细胞C6中异常表达的同源盒基因中HoxA族基因的种类。方法：应用HoxA族基因特异引物，对原代培养大鼠正常脑组织星形胶质细胞和胶质瘤C6细胞进行逆转录PCR。结合图像分析法分组检测HoxA族11种基因mRNA的表达水平。统计分析比较两种细胞中HoxA族基因表达水平。Hox基因表达水平用基因／β-肌动蛋白（β—actin）灰度比值表示。结果：HoxA3、A5、A6、A7、A9、A11、A13基因在正常脑组织和C6细胞中表达没有显著差异；HoxA1基因在正常大鼠和胶质瘤细胞C6中表达虽有显著差异，但均为弱表达；HoxA4基因在正常脑组织中弱表达，在C6细胞中有明显表达，二者比较，差异显著（P〈0.01）；HoxA2、HoxA10基因在正常大鼠脑组织中未见表达，在胶质瘤细胞c6中有明显表达。结论：HoxA2、A4、A10基因mRNA表达增高，可能与胶质瘤的发生、发展相关。     

铅对发育期大鼠海马细胞凋亡的诱导和XIAP、Smac基因表达的影响

背景与目的:观察醋酸铅对发育期大鼠海马区细胞凋亡及其相关基因XIAP和Smac mRNA表达的影响,以揭示铅的神经毒作用机制.材料与方法:48只健康雄性1月龄SD大鼠,被随机分为:对照组(给予双蒸水灌胃6周),实验组分别按低、中、高剂量,依次给予2、20、200 rag/ks醋酸铅溶液灌胃6周.以石墨炉原子吸收法测血铅浓度;用TUNEL法检测大鼠脑组织细胞凋亡的发生情况;用RT-PCR检测海马细胞XIAP和Smac mRNA的表达.结果:大鼠血液中的铅浓度随染铅浓度的增加而升高(P＜0.01).各醋酸铅剂量组大鼠海马组织凋亡细胞数量明显增加,其凋亡指数显著高于对照组(P＜0.01),并且随染铅浓度的上升而增加;大鼠海马组织的XIAP基因表达有下降趋势,高铅剂量组显著低于对照组(P＜O.01).相关分析显示XIAP基因表达水平与血铅浓度呈负相关.各组大鼠海马组织的Smac基因表达水平无明显差别,和血铅浓度也无相关性(P均＜0.05).结论:铅可诱导发育期大鼠的海马细胞凋亡率上升,该现象可能是通过抑制细胞X/AP基因的表达来发挥作用的.     

冬凌草甲素对人类食管癌SHEEC细胞基因表达的影响及其靶基因筛选

 目的　检测冬凌草甲素（ORI）对人类食管癌SHEEC细胞基因表达的影响并筛选与细胞凋亡密切相关的靶基因。方法　应用基因芯片技术检测32 μg／ml ORI作用SHEEC细胞1 h及8 h前后的基因表达差异,分析筛选差异表达基因,并用荧光定量PCR进行验证。结果　32 μg／ml ORI作用SHEEC细胞1 h及8 h后,表达上调≥2倍及表达下调≥2倍的基因共1011个,其中,1 h有 280个,8 h有731个。在1011个差异表达基因中,最后筛选出17个重复检测表达上调或表达下调幅度大且与细胞凋亡、信号转导和转录调控相关的基因。荧光定量PCR对17个差异表达基因进行验证,其中12个基因具有统计学意义。结论　在12个有统计学意义的差异表达基因中,可能有ORI经线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡的靶基因。     

BCR／ABL基因对PTEN介导的信号通路在K562细胞增殖和凋亡中的影响

目的：探讨BCR／ABL融合基因对抑癌基因PTEN介导的信号传导通路在K562细胞增殖和凋亡中的影响。方法：用不同浓度的格列卫（0．5、1、2、5、10μg／ml）干预K562细胞不同时间,观察其对细胞增殖的影响。用1μg／ml浓度的格列卫干预K562细胞不同时间（12、24、36、48、72h）后,通过荧光定量PCR检测细胞BCR／ABL、PTEN、mTOR mRNA水平的变化,并分析它们之间的相互关系。Western blotting检测细胞Akt和p-Akt水平,分析BCR／ABL融合基因对HEN mRNA表达的影响。结果：1μg／ml格列卫作用K562细胞后随着BCR／ABL融合基因表达减低,PTEN mRNA表达上调,mTOR mRNA表达下调,p-Akt表达下调。48h后随着BCR／ABL融合基因的抑制减弱,PTEN mRNA表达进而减低,而mTOR mRNA表达升高,p-Akt持续降低。BCR／ABL mRNA表达与PTEN mRNA表达呈负相关（r=-0．881,P〈0．05）,与mTOR mRNA及p-Akt表达呈正相关（依次为r=0．961,r=0．879,P均〈0．05）。结论：BCR／ABL融合基因可以通过抑制PTEN基因表达,调控P13K／Akt、mTOR信号传导通路,参与细胞增殖、凋亡及细胞周期调控等生物学特性。     

IGF-I、IGF-II及其受体在肝癌和癌旁肝组织中的表达

目的:探讨胰岛素样生长因子I、II及其受体在肝癌和癌旁肝组织中的表达及其意义.方法:采用DNA RNA原位杂交方法检测肝癌和癌旁肝组织中IGF-I、IGF-II及其受体mRNA的表达.结果:在肝癌组织中IGF-I、IGF-I受体、IGF-II、IGF-II受体mRNA的表达率分别为40.0%、46.7%、66.7%和63.3%,在癌旁肝组织中IGF-I、IGF-I受体、IGF-II、IGF-II受体mRNA的表达率分别为46.7%、53.3%、70.0%和73.3%,有36.7%的肝癌和50.0%的癌旁肝组织同时表达四种mRNA.IGF-I、IGF-II及其受体mRNA在分化较差的肝癌细胞、肝细胞再生结节和不典型增生肝细胞中阳性信号最强.结论:IGF-I、IGF-II及其受体在肝细胞癌变过程中发挥重要作用,肝癌的发生发展与IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR的协同作用有关.     

短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

 目的　研究短发夹RNA（shRNA）对耐三氧化二砷（As2O3）的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用。方法　设计并合成3条针对MRP1基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562／AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量。结果　经MRP1 shRNA作用24 h后,K562／AS2细胞株中MRP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降,最大下调幅度分别为（79.1±0.07）% 和（62.48±0.86）%（P＜0.05）,同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加（P＜0.05）。结论　MRP1 shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562／AS2细胞MRP1基因的表达。