自身免疫性肝炎患者可溶性肝抗原特异性T淋巴细胞反应特点及其临床意义

目的 分析评价AIH患者SLA特异性T淋巴细胞反应特点.方法 用化学法人工合成SLA序列多肽段作为刺激肽,刺激31例AIH患者(SLA/LP抗体阳性10例,SLA/LP抗体阴性21例)、30例PBC患者、29例病毒性肝炎患者和30名健康人中PBMC,使其分泌干扰素γ(IFN-γ),并采用ELISpot方法观察各组SLA肽特异性T淋巴细胞反应特点.结果 31例MH患者中18例患者PBMC对SLA肽库刺激可诱导分泌IFN-γ,其阳性率58.06%(18/31),PBC、病毒性肝炎患者、健康人阳性率分别为3.33%(1/30)、3.45%(1/29)、0.00%(0/30),AIH患者PBMC受SLA肽库刺激分泌INF-γ阳性率明显高于PBC、病毒性肝病患者及健康人(x2值分别为21.295、20.655、15.988,P均＜0.01).18例AIH患者反应单肽位于SLA中8个抗原簇,包括aa1～44、aa57～132、aa129～180、aa177～196、aa 193～244、aa241～268、aa281～308、aa321～428;平均识别SLA序列单肽宽度为6(2～17)条,显示多克隆性.18例呈阳性反应的AIH患者中14例患者在采集PBMC同时进行肝功能检测,该14例患者识别SLA序列单肽的反应宽度与谷草转氨酶(AST)对数值呈正相关(r=0.539,P＜0.05).结论 SLA肽库可诱导AIH患者外周血PBMC分泌IFN-γ,其反应呈多克隆性,反应宽度间接反映患者肝脏炎症活动程度.     

游离前列腺特异性抗原与总前列腺特异性抗原的检测及临床应用

前列腺癌（PC）是老年男性的主要常见恶性肿瘤之一而前列腺特异性抗原（PSA）是对前列腺癌监测和评估的重要指标。虽然PSA水平在前列腺癌明显增加，但在前列腺其他良性疾病也会增高，所以单凭血清PSA水平变化对PC的早期诊断、预后判定是不够理想的。近年来的研究犤１、２犦认为，PSA在血清中以多种形式存在，其主要与蛋白酶抑制物形成复合物，但还有少量未结合的PSA即游离PSA（fP－SA），其比值对区分前列腺增生（BPH）和PC有非常重要意义。为此，我们采用化学发光技术对１５３份血清标本进行了血清fPSA，PSA测定并求出比值…     

诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的白血病相关抗原研究进展

利用白血病细胞相关抗原可诱导抗白血病细胞特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），主要是白血病细胞超表达抗原、融合蛋白、次要组织相容性抗原、突变基因产物、分化抗原和独特型抗原等6类抗原具有该作用。     

胶原诱导关节炎模型小鼠CCP抗原特异性T细胞的量子点标记检测及其与CCP特异性淋巴细胞增殖的关系

目的建立基于量子点(quantum dots,QDs)标记环瓜氨酸肽(CCP)抗原特异性T细胞(CCP-AST)的流式细胞分析术(FCM),研究胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型小鼠CCP-AST的阳性率及其与CCP抗原特异性淋巴细胞增殖的关系。方法构建CIA小鼠模型,用QDs标记链霉亲合素(QD705-SA)结合生物素化的CCP对CCP-AST(CD4+CD8-CCP-TCR+)进行体外标记与FCM检测,同时将CCP与小鼠脾单个核细胞(MSMC)进行共培养,并对其增殖刺激指数(SI)、CCP-AST阳性率及其他参数做相关分析。结果成功建立检测QDs标记CCP-AST的FCM术,发现CIA组小鼠CCP-AST阳性率[中位数(第25分位数,第75分位数)]为0.575%(0.475%,1.185%),显著高于PD2B对照肽的0.165%(0.113%,0.240%)和健康组小鼠的0.085%(0.000%,0.205%),差异均有统计学意义(P均0.01)。CIA组小鼠经CCP刺激,MSMC出现明显的增殖反应,SI值为4.710,高于健康组小鼠CCP刺激的SI值0.860,差异有统计学意义(P0.01)。相关性分析显示,CIA组小鼠CCP-AST阳性率与CCP刺激MSMC的SI值呈显著正相关关系(r=0.734,P0.05),与关节炎症指数之间亦呈正相关(r=0.611,P0.05)。结论 QD705-SA结合生物素化的CCP,可实现对CCP-AST的有效标记和FCM检测,CIA组小鼠CCP-AST阳性率与CCP抗原刺激的特异性淋巴细胞增殖结果显著相关,并与CIA小鼠关节肿胀和炎症程度关系密切。     

人巨细胞病毒特异性T淋巴细胞检测的研究进展

人巨细胞病毒 (HCMV)是疱疹病毒的一种 ,在不同人群中的感染率为 5 0 %～ 90 %。初次感染后 ,在宿主免疫的控制下潜伏于骨髓等细胞中。当免疫功能受损时 (移植、获得性免疫缺陷综合征、肿瘤等 ) ,潜伏的病毒易被激活 ,严重者可引起致死性肺炎、肝炎[1] 。大量研究表明 ,特异性细胞免疫对HCMV感染的控制和疾病的恢复起重要作用 ,尤其是CD8+ T对控制HCMV感染更为重要[1,2 ] 。Cwynarski等[3 ] 研究发现 ,HCMV潜伏感染期 ,如特异性CD8+ T在免疫正常者中为 0 4～ 0 8× 10 7/L ;而肾移植受者为≥ 1× 10 7/L时 ,均可阻止病毒的激活…     

肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞和肿瘤免疫治疗

肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞(CTL)是重要的抗肿瘤细胞。本文介绍了抗原呈递及CTL识别的分子基础，并对肿瘤相关抗原(TAA)及T细胞表位的鉴定、肿瘤相关抗原肽诱导特异性CTL应答的免疫原性、肿瘤相关抗原肽疫苗治疗肿瘤的原理以及T细胞免疫应用前景做一综述。     

MHC五聚体方法检测基因疫苗体外诱导的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞

目的 探讨MHC五聚体方法检测在体外用抗B细胞淋巴瘤基因疫苗(简称基因疫苗)刺激PBMC生成抗原特异性CTL的效率.方法 用于细胞培养的4份血液标本来自2例B淋巴细胞肿瘤患者(1例为滤泡性淋巴瘤患者,另1例为毛细胞白血病患者)和2名健康对照者.分别检测上述标本中PBMC受基因疫苗刺激后CTL生成情况.PBMC贴壁培养获得DC前体,在重组细胞因子GM-CSF和IL4的支持下诱导培养DC,采用基因枪方法将基因疫苗质粒导入DC,RT-PCB方法检测转染后细胞IgHV1-GM-CSF mRNA的转录,ELISA方法检测细胞因子GM-CSF的表达,并验证转染是否获得有效表达.转染后的DC再与从PBMC中获得的淋巴细胞共培养,诱导抗原特异性的CTL;共进行2次DC刺激,共计培养24 d,分别在培养前、培养第7天、第17天及第24天收获培养细胞,培养分为转染基因疫苗组和转染对照质粒组,流式细胞术分析培养细胞中CD3+ CD8+细胞亚群的水平;用针对基因疫苗抗原肽抗原表位的MHC五聚体荧光抗体检测CTL产生水平.结果 基因枪颗粒轰击方法转染DC后,RT-PCR结果显示转染得到了表达;转染基因疫苗组的DC中GM-CSF含量为(28±6)ng/106个细胞,而转染对照质粒组的DC中GM-CSF含量为(10±3)ng/106个细胞,差异有统计学意义(t=5.191,P<0.01).分析培养后的T淋巴细胞亚群,显示随着培养时间的延长,CD3+CD8+细胞亚群比例明显增加,转染对照质粒组在培养前、培养第7天、第17天和第24天的比例分别为(34.24±2.72)%,(46.06±3.08)%,(65.34±4.26)%,(73.86±4.85)%,而在转染基因疫苗组,其比例分别为(32.28±2.08)%,(45.32±3.81)%,(63.37±4.21)%,(75.01±3.20)%.两因素方差分析显示培养不同时间点的CD3+CD8+细胞亚群比例差异有统计学意义(F培养时间=176.966,P<0.01),但转染因素本身对其产生的影响差异无统计学意义(F转染因素=0.657,P>0.05).MHC五聚体检测结果显示转染基因疫苗组的DC能够诱导针对该表位的抗原特异性CTL产生,CTL水平随着DC的刺激逐渐增高;在培养第24天,健康对照者最高获得2.03%的CTL,滤泡性淋巴瘤患者的CTL达4.36%,而毛细胞白血病患者为3.89%.结论 MHC五聚体方法能够有效检测基因疫苗诱导的抗原特异性CTL;该方法对于抗肿瘤细胞免疫的检测、肿瘤患者的细胞免疫状态及早期预后判定可能是一项有前景的临床检验方法.     

肺结核病人CD4+ 记忆T细胞亚群的检测分析

目的 研究肺结核病人外周血总的CD4+ 记忆T细胞及抗原特异性记忆T细胞的产生及分布规律,了解记忆T细胞在结核发病中的作用。 方法 以荧光标记的抗CD4、CCR7、CD45RA三种抗体共染色,用流式细胞仪检测肺结核病人外周血总的CD4+ 记忆T细胞;以荧光标记的抗CD4、CD154、CCR7、CD45RA四种抗体共染色,检测结核抗原特异性CD4+ 记忆T细胞。通过对比分析,了解记忆T细胞分布特征。 结果 肺结核病人外周血总的CD4+ T细胞中初始T细胞、中央型记忆T细胞和效应型记忆T细胞的比例分别为59.18%±16.11%、15.4%±6.48%和16.3%±9.97%;而在抗原特异性CD4+T细胞中初始T细胞、中央型记忆T细胞和效应型记忆T细胞的比例分别为32.67%±13.94%、56.96%±12.7%和8.76%±5.62%。通过统计学比较后发现,总的CD4+ T细胞和抗原特异性CD4+ T细胞这两组之间初始细胞、中央记忆细胞和效应记忆细胞的分布均有显著性差异。 结论 肺结核病人外周血总的CD4+ T细胞中以初始细胞为主,而抗原特异性CD4+ T细胞中则以中央记忆细胞为主,说明结核病患者可以产生抗原特异性记忆T细胞,参与长效免疫,可能在防止再感染或者降低再感染的严重程度方面起了重要的作用。     

T淋巴细胞识别的肿瘤抗原

目前已经发现，至少有４种与恶性状态转化和发展有关的蛋白可使肿瘤细胞有免疫原性：突变的癌基因编码的蛋白；染色体易位形成的融合蛋白；过度表达的正常自身蛋白和翻译后修饰异常的蛋白。     

人外周血单核细胞来源树突状细胞转染重组腺相关病毒诱导特异性T细胞的效应

目的:观察人外周血单核细胞来源的树突状细胞转染含前列腺特异性抗原片段的重组腺相关病毒后,其所诱导的特异性T细胞对前列腺癌细胞株LNCaP和DU145的体外杀伤抑制作用。方法:实验于2006-05/10在南方医院肿瘤科生物室完成。①对象:HLA-A2基因亚型的健康自愿供血者1名,对本实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。作为靶细胞的前列腺癌细胞株LNCaP、DU145以及携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒由美国阿肯色大学生物治疗中心刘勇教授惠赠。②实验方法:抽取HLA表型为A2的健康自愿供血者外周血50mL,Ficoll法分离单核细胞体外培养,磷酸盐缓冲液洗涤6孔板,收集悬浮细胞作为效应T细胞,贴壁细胞即为树突状细胞。向6孔板内加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒,第4天加入白细胞介素4,第6天加入肿瘤坏死因子α,至培养第7天收获悬浮细胞即为成熟的树突状细胞。③实验评估:应用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子标记的表达。以ELISA法检测树突状细胞分泌白细胞介素12的含量。将成熟树突状细胞与效应T细胞分别按1:10、1:20、1:40进行共培养,将未经过树突状细胞共育的T细胞设置为空白对照组,ELISA法检测效应T细胞分泌干扰素γ的含量。LNCaP、DU145靶细胞分别与效应T细胞按效靶比5:1、10:1、20:1、40:1进行共培养,MTT法检测效应T细胞对两种靶细胞的杀伤作用。结果:①树突状细胞表面分子标记的表达:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒致敏后的树突状细胞,培养8d后高表达CD83.CD40.HLA-DR,CD80,CD1a,CD86,分别为65.8%,66.0%,96.7%,70.0%,61.9%.79.0%。②树突状细胞释放白细胞介素12含量检测:与培养第1天比较,第7天成熟树突状细胞释放白细胞介素12的含量显著升高(P<0.05)。③效应T细胞释放干扰素γ含量检测:与空白对照组比较,树突状细胞:T细胞按1:10、1:20、1:40共培养后所释放的干扰素γ含量均明显升高(P<0.01.0.01,0.05),且随树突状细胞加入比例的提高有所增加。④效应T细胞的细胞毒性作用检测:效应T细胞可有效识别并杀伤HLA-A2阳性的LNCaP细胞,其抑制作用在效靶比为10:1、20:1、40:1时均显著强于DU145细胞株(P<0.01)。结论:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒转染后的树突状细胞,其细胞表型和刺激淋巴细胞增殖、分化的功能无明显改变,可诱导自体效应T细胞增殖,该效应T细胞对LNCaP细胞具有明显杀伤作用。     

葡萄膜炎患者视网膜S抗原特异性T细胞的检测

目的联合酶联免疫斑点法(ELISPOT)及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测葡萄膜炎患者外周血视网膜S抗原(S-Ag)特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞,探讨S-Ag介导的细胞免疫反应是否参与了人葡萄膜炎炎症发展过程。方法选取活动期葡萄膜炎患者23例作为研究对象,以14例健康志愿者作为正常对照,采集受试者肘静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC)。提取、纯化牛S-Ag,以牛S-Ag作为刺激剂与PBMCs共培养,以不加抗原作为阴性对照,以加anti-CD3单克隆抗体作为阳性对照。应用ELISPOT法检测IFN-γ分泌细胞的数量以鉴定T细胞对S-Ag的反应性,同时确定S-Ag特异性Th1细胞的频率;应用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的水平,从整体水平检测Th1型免疫反应。结果 60.9%(14例)的葡萄膜炎患者的PBMCs对S-Ag的刺激产生免疫反应,S-Ag特异性Th1细胞的频率为7.4±4.7SFC/2×105PBMCs。阴性对照组均未见阳性细胞染色,阳性对照中,对S-Ag有反应患者和对S-Ag无反应患者的IFN-γ分泌细胞数量相同,但较正常人均显著增多(P=0.006,P=0.004)。细胞培养上清中检测到不同程度的IFN-γ表达,与阴性对照相比,对S-Ag有反应患者IFN-γ表达量显著增高(P=0.018),对S-Ag无反应患者及正常人表达量无明显变化。阳性对照中,对S-Ag有反应患者和对S-Ag无反应患者IFN-γ分泌量相同,但较正常人均增多(P=0.013,P=0.036)。结论大部分葡萄膜炎患者体内存在S-Ag特异性T细胞,这群细胞介导的Th1型免疫反应在葡萄膜炎发生、复发过程中发挥重要作用。     

高强度聚焦超声制备抗原致敏树突状细胞及其诱导细胞毒性T淋巴细胞杀伤效应的研究

目的 探讨高强度聚焦超声(HIFU)制备抗原致敏树突状细胞(DC)及其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤效应.方法 应用小鼠重组GM-CSF和IL-4培养小鼠骨髓DC,用HIFU制备CT26肿瘤细胞抗原致敏DC疫苗,用3H-TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4 h 51Cr 释放测定法检测CTL杀伤活性.结果 HIFU组、肿瘤细胞冻融组、肿瘤上清组和PBS组的DC在体外均可以诱导CTL增殖,但HIFU组、肿瘤细胞冻融组的DC体外诱导CTL增殖能力明显高于肿瘤上清组和PBS组(P＜0.05).HIFU组和肿瘤细胞冻融组DC体外诱导的CTL对CT26结肠癌均有明显的细胞毒性作用,与肿瘤上清组DC和PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),HIFU组体外诱导的CTL杀伤活性与肿瘤细胞冻融组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HIFU制备抗原致敏DC可以诱导CTL大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL.     

自身免疫性肝炎患者CD4＋T细胞及其细胞因子的表达水平及意义

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）是免疫介导的以肝细胞损害和血清肝细胞炎症指标升高为主要表现的自身免疫性疾病,是导致肝硬化及肝功能衰竭的主要病因之一[1].研究证实,CD4＋T淋巴细胞的数量和（或）功能异常可引起炎症反应并诱导多种自身免疫性疾病的发生,但目前其与AIH的关系尚不明确.     

同种异基因抗原特异性调节性T细胞的体外扩增

目的建立用人B淋巴细胞体外获得大量的同种异基因抗原特异性调节性T(Treg)细胞的方法,以此检测扩增细胞的表型及其免疫无能性和免疫抑制性。方法第1轮扩增将免疫磁珠分选的人CD4+CD25+T细胞和人B淋巴细胞按1∶4体外混合培养,并加入外源白介素-2(IL-2)和抗-CD28;将第1轮扩增得到的Treg细胞用抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠和IL-2刺激,做第2轮扩增以获得更多数量的抗原特异性Treg细胞,分为添加和或未添加免疫抑制剂雷帕霉素(RAPA)2组(n=3)。结果经过2轮的扩增后,在第2轮扩增中未添加RAPA组扩增1×103倍,纯度80%;添加RAPA组扩增0.8×103倍,纯度90%。添加RAPA组得到的Treg细胞的Foxp3、CT-LA4、CD39表达水平高于未添加RAPA组,但是HLA-DR变化不大;未添加RAPA组扩增得到的Treg细胞分泌低水平的IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ,而添加RAPA组得到的Treg细胞几乎不分泌上述各种细胞因子,前者表现出部分免疫反应无能性,后者表现出完全的免疫反应无能性,两者都表现出免疫抑制性功能特征。人B淋巴细胞扩增得到的抗原特异性Treg细胞能够极大地抑制同源抗原引起的免疫反应,而对多克隆刺激的免疫反应抑制能力较弱。结论用人B细胞体外扩增抗原特异性Treg细胞,再通过抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠进一步刺激可以体外获得大量的抗原特异性的Treg细胞,加入RAPA后可有效地提高Treg细胞的纯度和免疫抑制力且呈现抗原特异性。     

粒细胞特异性NA抗原的检测及临床意义

1 粒细胞特异性NA抗原1960年Lalezari等在研究中性粒细胞减少症的新生儿患者时,报告了第一例中性粒细胞抗体并将其相应的抗原命名为NA1(neutrophil antigen),这种抗体能够凝集50%的白种人粒细胞.     

人工抗原呈递细胞复合物体外诱导特异性T淋巴细胞活化的研究

本研究旨在以人工抗原呈递细胞（artificial antigen—presenting cells，amPfs）体外模拟树突状细胞生物学功能，探讨诱导特异性T淋巴细胞活化、增殖的作用。以磁性微珠为载体，选取慢性髓系白血病特异性抗原CML28作为目标抗原肽，通过抗原表位预测软件获取CML28表位序列（Vltfaedsv），并以该抗原表位与MHC分子（HLA—A2-Ig）偶联，作为第一信号分子，B7—1分子作为第二信号分子，将两种信号分子同时负载于磁珠表面，构建人工APC复合体；取HLA—A2^＋的健康骨髓捐赠者骨髓单个核细胞，以磁珠分选出CD8^＋T淋巴细胞并与人工APC复合体系统共培养。培养过程中加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（5，6-carboxylfluorescin diacetate succinimidyl ester，CFSE），并以此检测T细胞增殖，用流式细胞仪检测特异性T细胞增殖程度。结果发现：实验组中CML28一特异性T细胞增殖程度明显增高，实验组平均值为（17.34±0．35）％，对照组平均值为（2．25±0．43）％，两者比较差异显著（P〈0．01）。结论：人工APC复合体系统在体外能模拟人体抗原呈递细胞，刺激CD8^＋T特异性淋巴细胞活化、增殖。     

组织相容性抗原-肽四聚体流式的细胞技术检测乙型肝炎患者特异性CD8+T细胞

目的　探讨组织相容性抗原 (HLA) 肽四聚体流式细胞技术检测乙型肝炎病毒特异性CD8 T细胞的临床应用价值。方法　采用HLA A2分子胞外段与乙型肝炎病毒 (HBV)核心表位肽core 18 2 7结合的HLA 肽四聚体 (Tetramer) ,设计流式细胞技术检测乙肝患者外周血中针对该肽段的特异性CD8 T细胞数量 ,以占总计数CD8 细胞数的百分比表示。结果　 11例HLA A2 的急性乙肝患者外周血特异性CD8 T细胞为 0 0 2 %～ 2 0 4 % ,中位数为 0 2 0 % ,16例HLA A2 的慢乙肝患者为<0 0 1%～ 0 6 5 % ,中位数为 0 0 5 % ,二组之间差有显著性 (P <0 0 1)。 15例HLA A2 正常对照组、13例HLA A2 -急性乙肝对照组和 19例HLA A2 -慢性乙肝对照组的特异性的CD8 T细胞均不超过0 0 2 %。结论　HLA 肽四聚体流式细胞技术能在体外直接检测HBV特异性的CD8 T细胞数量 ,其水平一定程度上反映了特异性CTL应答状况 ,且与乙肝的不同临床转归有关。     

淋巴细胞缺乏状态对白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞体内抗白血病效应的影响

目的探讨淋巴细胞缺乏状态对白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体内增殖和抗白血病作用的影响。方法采用6 Gy照射C57BL/6小鼠诱导淋巴细胞缺乏状态,分别经尾静脉注射EGFP+C57BL/6小鼠脾T淋巴细胞和白血病特异性CTL,随后皮下接种1×106FBL3白血病细胞。用流式细胞仪分析小鼠外周血EGFP+细胞及T淋巴细胞亚群比例,同时观察脾T淋巴细胞和白血病特异性CTL对随后接种的FBL3白血病细胞的杀伤作用。结果在淋巴细胞缺乏状态下输入的脾T淋巴细胞和白血病特异性CTL均可得到有效扩增(第18天输注脾T淋巴细胞组和输注CTL组外周血中EGFP+细胞比例分别为28.81%和42.24%),但脾T淋巴细胞对随后接种的白血病细胞生长无抑制作用,而白血病特异性CTL在淋巴细胞缺乏受体小鼠体内扩增速度更快,扩增的倍数更高,并具有显著增强的抗白血病作用。结论诱导受体淋巴细胞缺乏可显著增强外源性CTL输注的疗效。     

诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的白血病相关抗原研究进展

利用白血病细胞相关抗原可诱导抗白血病细胞特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),主要是白血病细胞超表达抗原、融合蛋白、次要组织相容性抗原、突变基因产物、分化抗原和独特型抗原等6类抗原具有该作用。