乙型肝炎病毒S基因序列的多态性分析

乙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ,ＨＢＶ）至少含有４个开放阅读框架（ＯＲＦ）,定位于负链,分别为Ｓ、Ｃ、Ｐ和Ｘ基因。Ｓ基因变异的热点,也是临床及流行病学调查中最有意义的变异是“ａ”决定族基因组的突变。我们探讨了Ｓ基因（“ａ”决定簇）序列的多态性,为进一步研究ＨＢＶ基因变异提供参照。１．资料与方法：对象为ＨＢＶ感染者３１例,来自江南地区。ＨＢｓＡｇ均阳性,抗－ＨＢｓ均阴性;其中１６例ＨＢｅＡｇ阳性,１５例阴性;抗－ＨＢｃ均阳性。其中男２５例,女６例,年龄４～７０岁。慢性无症状ＨＢｓＡｇ…     

乙型肝炎病毒S基因变异与临床

变异是生物界普遍存在的现象，是物种适应生存压力的结果。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)与其它DNA病毒相比具有很高的变异率。随着研究的深入，表明乙型肝炎病毒S基因变异与乙肝疫苗预防接种失败、HBIG预防移植后肝脏再感染、HBsAg(-)的HBV感染及疾病严重性等均有密切关系。本文就HBV S基因变异及其在临床中的意义作一综述。     

乙型肝炎病毒S区准种与疾病活动性的关系

目的　通过对慢性乙型肝炎不同病型患者S区准种复杂性差异的分析 ,探讨S区准种与疾病活动性的关系。方法　选择HBVDNA阳性患者共 112例 ,其中慢性重型肝炎 (FHF) 6 0例 (同时有肝硬化者 38例 ) ,慢性轻、中型肝炎 (CH) 30例 ,病毒携带者 (ASC) 2 2例 ,采用单链构像多态性(SSCP)和DNA序列分析方法检测HBVS区准种。结果　不同疾病期SSCP条带数不同 ,分别为ASC( 1.4 5± 0 .13) ,CH( 3.70± 0 .2 2 ) ,FHF( 5 .93± 0 .2 4 )。准种复杂性随疾病进展而增加 ,组间比较差异有显著性 ,F =72 .73,P <0 .0 1。HBeAg阳性与HBeAg阴性患者SSCP条带数分别为 3.4 1± 0 .2 7和 5 .2 7± 0 .30 ,两组差异有显著性 (t =4 .5 3,P <0 .0 1)。HBV基因型B、C患者SSCP条带数分别为 4 .71± 2 .36和 3.0 6± 1.76 ,差异有显著性 (t =2 .6 6 ,P <0 .0 1)。 2例重型肝炎患者随访 1年后丙氨酸转氨酶 (ALT)分别由 5 6 7.2U/L、4 6 2 .3U/L降至正常和接近正常 ( 4 2 .8U/L) ,SSCP条带数分别由 9、7条减至 5、2条 ;1例ASC随访 1年SSCP方式仍维持 1条带不变 ,ALT水平高低与SS CP条带数多少相一致。经DNA序列分析 ,证实了SSCP显示的HBV准种性。结论　HBVS基因准种随疾病病情加重而复杂性增加 ,其增加程度与HBeAg阴性、病情轻重及基因型     

乙型肝炎疫苗母婴阻断失败与乙型肝炎病毒S基因变异

目的　探讨母亲感染HBV基因变异在乙型肝炎 (乙肝 )疫苗母婴阻断失败过程中所起的作用。方法　PCR直接测定母婴HBVS基因序列 ,对婴儿存在HBVS基因变异而母亲未发现者 ,进一步通过克隆筛选法对母亲所感染的HBV进行S基因亚群分析。结果　 11例乙肝疫苗母婴阻断失败者中有 3例幼儿存在S基因“a”决定簇的氨基酸变异 ,其中 1例幼儿母亲也存在相同的变异。对另 2例母亲所感染的HBV进行S基因亚群分析发现 ,1例母亲 9个克隆所测序列与其原序列完全一致 ;另 1例母亲 8个克隆中 ,有 6个克隆与其原序列一致 ,另 2个克隆与其幼儿所感染的HBV序列一致。结论　乙肝疫苗母婴阻断失败者感染的HBVS基因变异株可能早已存在于母亲体内 ,通过免疫选择传染给患儿。     

不同结合臂长10-23 DNAzymes对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达的抑制作用

目的探讨不同结合臂长10-23DNAzymes在2．2．15细胞内对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达的抑制作用。方法设计并合成不同结合臂长的10-23 DNAzymes,能分别针对乙型肝炎病毒S基因和C基因开放阅读框A^157UG和A^1816UG。不同的10-23 DNAzymes分别转染2．2．15细胞,放射免疫分析法测定2．2．15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平,实时荧光定量PCR法测定2．2．15细胞培养上清中HBVDNA水平。MTT法检测细胞毒性。结果不同结合臂长的10-23 DNAzymes在0．1—2．5μmol／L浓度范围内均能有效抑制HBsAg和HBeAg的表达,抑制效应可长达72h。在同一剂量相同转染时间的条件下,不同结合臂长的10．23 DNAzymes对HBsAg和HBeAg表达的抑制率呈以下关系：DrzBS-9〉DrzBS．8〉DrzBS-7;DrzBC-9〉DrzBC．8〉DrzBC-7。DrzBS-9和DrzBC-9在2．5~mol／L剂量条件下,转染48h后对HBsAg和HBeAg表达的抑制率可分别高达95％和92％。不同结合臂长的10-23DNAzymes对2．2．15细胞培养上清中HBVDNA水平并无明显影响。MTT细胞毒性检测表明,在0．1～2．5μmol／L浓度范围内未见10-23 DNAzymes对2．2．15细胞的毒性作用。结论不同结合臂长10-23 DNAzymes在2．2．15细胞内对乙型肝炎病毒s基因和c基因表达均有一定的抑制作用,DrzBS-9和DrzBC-9的抑制作用较强。     

苏南地区乙型肝炎病毒S基因序列的多态性研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)S基因序列的多态性,为研究HBV-S基因变异提供参照指导。方法:采用聚合酶链反应技术对81例乙型肝炎表面抗原阳性的HBV感染者的S基因进行扩增,再对扩增产物进行DNA测序,将结果与标准序列进行比较分析。结果:81价标本中,测得adr型38例,adw型43例,未发现有ayr及ayw型。38例adr型中氨基酸第121～125位点(AA121～125)、AA127～130、AA132、AA135～160高度保守,而AA126为异亮氨酸(Ile),也可为苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser);AA131多为Thr,少数为天冬酰胺(Asn),1例为脯氨酸(Pro),AA133多为蛋氨酸,少数为Thr;AA134为苯丙氨酸,仅1例为精氨酸。43例adw型中,AA131均为Thr,而非Asn;AA126为Thr,也可为丙氨酸(Ala),少数为Ser;AA127多为Pro,少数为Thr;AA123为Thr,少数为Ala或Ile;AA141多为赖氨酸,少数为谷氨酸;AA133、AA140分别为Thr、Ile各1例。其他位点则高度保守。结论:HBV亚型分布具有地域性,苏南地区多以adw和adr型为主。HBV-S基因(“a”决定簇)序列存在多态性,其中adw亚型略为明显。     

胸腺素及干扰素基因表达对乙型肝炎基因疫苗的免疫增强效应

目的观察胸腺素及干扰素基因表达对乙型肝炎基因疫苗pVAX1-S2S的免疫增强效应。方法从乙型肝炎患者血清中扩增S2S基因，构建表达质粒PVAX1—S2S。从成人外周血白细胞总RNA中，逆转录聚合酶链反应扩增干扰素α基因Ⅰ，将其与S2S相连接，构建重组表达质粒PVAX1—I／S2S；将干扰素α基因Ⅰ与人工合成的胸腺素α基因T相连接，构建重组表达质粒pVAX—T／I。将上述表达质粒分组肌肉接种BALB／c小鼠：单独免疫组接种pVAX1-S2S 100μg；联合免疫组1：接种pVAX1—I／S2S 100μg；联合免疫组2：每只小鼠同时接种pVAX1—T／I与pVAX1-S2S各50μg。上述各组于2、4周后分别加强免疫1次。然后动态检测小鼠血清抗-HBS和前S2抗体。结果接种后3、5、8周，小鼠血清抗-HBS阳转率：联合免疫组1分别为12．5％、12．5％、62．5％；联合免疫组2分别为25％、50％、50％，二者总体上均优于pVAX1—S2S单独免疫组。联合免疫组2的前S2抗体水平则高于其它两组。结论胸腺素α1和(或)干扰素α8基因的表达具有分子免疫佐剂的效应，能够增强乙型肝炎基因疫苗的特异性体液免疫诱生效力。     

乙型肝炎病毒S基因变异研究的新进展

预防和控制HBV感染是全球性的、迫切需要解决的难题。由于多样性HBV变异株的存在大大增加了解决这一难题的复杂性。随着分子生物学技术的不断发展,人们对HBV变异多样性的认识逐步深入,尤其是S基因变异的研究倍受重视。本文就S基因变异及其医学意义的研究新进展作一简要综述。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究现状

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)DNA疫苗是指通过克隆HBV抗原基因,并将其插入真核表达载体构建而成的重组DNA分子。通过皮下、肌肉注射或颗粒轰击技术将重组DNA分子导人体内,使目的基因在体内表达,从而诱导机体产生针对此种抗原的体液免疫和细胞免疫。     

乙型肝炎病毒S基因变异的研究现状

本文对乙型肝炎病毒Ｓ基因变异的类型、流行病学、变异的位点、可能的诱因、机制以及临床意义作一概述。     

HBx-GFP DN突变子长期稳定表达抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒基因的表达

目的　探索和寻找更有效的乙型肝炎治疗新的靶点和新的治疗方法 ,研究其抗病毒基因表达作用。方法　运用基因工程技术 ,建立了HBx GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白 (GFP)的长期稳定表达细胞克隆 ,Northernblot检测细胞内的乙型肝炎病毒相关基因RNA转录 ,应用RIA检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达 ,观察对乙型肝炎病毒基因表达的影响。 结果所构建的X GFP突变子 ,Xwt,GFP质粒均能在 2 .2 .15细胞株中稳定高效表达并使细胞上清液中HBsAgHBeAg表达水平分别较 2 .2 .15组的 ( 10 1± 5.5)ng/ml、 ( 12 1± 8.6)ng/ml显著降低为平均( 7.6± 11.5)ng/ml、 ( 3 5± 3 .5)ng/ml (P <0 .0 1) ,细胞内的病毒 3 .5kb ,2 .1kb及 2 .4kb的RNA与各对照组比较均有显著降低 ,以 2 .1kb及 2 .4kb的mRNA下降最为显著。结论　乙型肝炎X基因DN突变子X GFP能显著抑制乙型肝炎病毒基因转录和S ,C基因的表达。提示 ,X基因亦是乙型肝炎治疗的一个靶基因     

乙型肝炎病毒X基因克隆及表达的研究

目的克隆、表达并纯化乙型肝炎病毒Ｘ抗原,应用 ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析该抗原与乙型肝炎患者体内抗Ｘ抗体的特异性反应。方法应用基因扩增技术分离此蛋白的结构基因,采用基因工程的方法,应用融和表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,重组、克隆得到带有ＨＢＸ特异抗原基因的重组菌株,并应用ｗｅｓｔｅｒｎ印迹的方法检测乙型肝炎患者体内的抗Ｘ抗体。结果ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,该表达产物可与ＨＢＶ感染患者体内的抗Ｘ抗体特异性结合。结论纯化后的ＨＢＸ抗原可作为检测乙型肝炎患者抗Ｘ抗体的特异性抗原。     

子宫内传播中乙型肝炎病毒部分S区基因的变异

目的 以丈夫无乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染标志的４例女性携带者与妻子无ＨＢＶ感染标志的６例男性携带者及子宫内感染ＨＢＶ的胎儿为对象,研究子宫内传播中ＨＢＶ Ｓ区的变异。方法 以双脱氧链末端终止法检测母儿,父儿所携ＨＢＶ Ｓ区４５１－６６０位核苷酸序列。结果 母儿,父儿间同源性９８％－１００％,检出４９１,４９４,５３０,５４６,５８１位点变异致使１１３,１１４,１２６,１３１,１４３位氨基酸替代,其     

乙型肝炎病毒核心质粒的构建及原核表达

目的构建乙型肝炎病毒核心区原核表达质粒并进行原核蛋白表达、纯化和鉴定。方法应用基因工程技术将编码截短型乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg1～144aa)的基因片段装入原核表达载体pRSET-B内，在宿主菌B121(DE3)plysS内进行诱导表达，运用Ni—NTA方法纯化日的蛋白。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)及Western blot检测蛋白的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型乙型肝炎病毒核心区基因的质粒，并纯化得到了分子量约为19．5kD的目的蛋白：结论本方法所获得的重组截短型乙型肝炎病毒核心抗原(1～144a)纯度高，免疫反应性强：     

乙型肝炎病毒表面抗原基因的克隆及序列分析

目的克隆并鉴定乙型肝炎病毒表面抗原基因,为下一步构建该重组腺病毒载体以及进一步研究腺病毒载体的包装及在乙型肝炎病毒基因治疗中的作用。方法参照人 HBV adr 亚型序列,设计和合成 S 基因特异引物。应用 PCR 技术,从含有 HBsAg 的 HBV DNA 中扩增目的 DNA,通过 TA 连接将其克隆人 pGEM-T easy 载体,经限制性内切酶 BglⅡ/SalⅠ鉴定后,进一步测序鉴定。结果从乙肝表面抗原阳性(HBsAg )血清中成功提取 HBV DNA,并以此 DNA 为模板,成功扩增出 S 基因,测序结果与 GenBank 中注册的相应序列比对,核苷酸序列的同源性高达92％～99％,预测氨基酸序列同源性亦达82％。结论从 HBsAg 阳性血清中成功克隆出 S 基因序列,为进一步构建重组腺病毒及后续实验奠定了基础。     

乙型肝炎病毒B和C基因型全基因组的克隆与真核细胞表达

目的 构建B和C基因型重组HBV表达载体,检测其在Huh7细胞内的DNA复制和HBsAg、HBeAg的表达.方法 扩增B和C基因型HBV全基因组,并将其连接于真核表达载体pHY106,将这2个载体分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照.Southern印迹法检测转染72 h后HBV DNA的复制,实时定量PCR检测转染后24、48、72、96和120 h Huh7细胞内HBV DNA水平,ELISA检测转染后24、48、72、96和120 h细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的表达.结果 成功构建了B和C基因型HBV表达载体.转染Huh7细胞后72 h,Southern印迹法检测到细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括松弛环状DNA、双链DNA和单链DNA.实时定量PCR检测发现病毒DNA复制水平可达8 lg拷贝/mL、ELISA结果显示HBsAg和HBeAg的表达于转染后72 h达高峰,然后逐渐下降.结论 成功构建B和C基因型重组HBV真核表达载体,并能在Huh7细胞内高水平复制和表达,为进一步研究HBV的结构与功能、基因表达与调控,以及抗HBV药物的筛选等提供了良好的平台.     

Possible mechanism for hepatitis B virus X gene to induce apoptosis of hepatocytes

AIM: To investigate the possible mechanism for HBV X gene to induce apoptosis of hepatocyte HL-7702 cells. METHODS: HBV X gene eukaryon expression vector pcDNA3-X was established and transfected into HL-7702 cells by Iipid-mediated transfection, including transient and stable transfection. Positive clones were screened by incubating in the selective medium with 600 μg/mL G418 and named HL-7702/HBV-encoded X protein (HBx) cells. The expressions of Fas/FasL, Bax/Bcl-2, and c-myc mRNA were measured by semi-quantitative RT-PCR in HL-7702/HBx and control group, respectively. RESULTS: RT-PCR analysis confirmed that HBV X gene was transfected into HL-7702 cells successfully. By semi-quantitative RT-PCR analysis, Bax and c-myc mRNA levels in HL-7702/HBx cells of transient transfection were significantly higher than those in control, FasL and c-myc mRNA levels in HL-7702/HBx cells of stable transfection were significantly higher than those in control, whereas the Bcl-2 mRNA levels in HL-7702/HBx cells of transient and stable transfection were significantly lower than those in control. CONCLUSION: HBV X gene may promote the apoptosis of hepatocytes by regulating the expressions of Fas/FasL, Bax/Bcl-2, and c-myc gene in a dose-dependent manner.