兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的:软骨细胞在单层培养时,多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养,以保持其特有表型。方法:用酶消化法获取兔关节软骨细胞,分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养,并传代;或制成细胞/藻酸盐悬液,再进一步制成串珠,使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片,爱尔新蓝染色,采用倒置显微镜、透射电镜观察;以RT-PCR方法检测软骨细胞中II型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果:单层培养时有较高的细胞增殖率,5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围,特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得II型胶原和凝集聚糖的表达。结论:软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质,维持细胞特有表型的稳定。     

藻酸钠凝胶三维培养条件下胰岛素样生长因子Ⅰ对兔关节软骨细胞表型的影响

目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响。方法:实验于2004-10/2006-10在上海长海医院血管外科实验室完成。实验材料:4周龄雄性新西兰兔6只。实验方法:利用机械与酶消化的方法获得均一的兔关节软骨细胞,在单层培养条件下将软骨细胞增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养。细胞培养分组:①不含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养。②含50μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组。③单层培养。实验评估:①三维培养细胞于培养的2,4,6周行冰冻切片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。②单层培养细胞每传代1次行细胞爬片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:①细胞学外观形态变化:两组藻酸盐凝胶三维培养体系中的软骨细胞在6周的培养过程中始终保持了圆形的细胞外观。单层培养软骨细胞在第5代以前,均保持了星形及多角形的正常软骨细胞外观。②免疫组织化学显示结果:培养6周后,含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养软骨细胞特异性Ⅱ型胶原细胞仍呈强阳性染色,表达水平较转入三维体系前未见降低,培养细胞保持了良好的分化表型。单层培养软骨细胞在第5代以前,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性。第6代以后,大部分细胞呈梭形,向成纤维细胞转化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐三维培养条件下的关节软骨细胞表型具有维持作用。     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的 观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征，探计用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法 用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞，观察细胞形态学变化，测定细胞数量变化及其生长曲线，观察细胞增殖；借助免疫组织化学的方法了解细胞Ⅱ型胶原的合成情况。结果 体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化，多数细胞变为成纤维细胞状，合成Ⅱ型胶原的能力明显减弱；而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍瓮中保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论 用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力，防止反分化的发生。     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征,探讨用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞,观察细胞形态学变化,测定细胞数量变化及其生长曲线,观察细胞增殖;借助免疫组织化学的方法了解细胞II型胶原的合成情况。结果体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化,多数细胞变为成纤维细胞状,合成II型胶原的能力明显减弱;而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力,防止反分化的发生。     

Ⅰ型胶原三维立体支架高密度培养软骨细胞的增殖及其分泌功能

目的：观察体外Ⅰ型胶原三维立体支架培养软骨细胞形态、增殖能力及Ⅱ型胶原表达的变化，并与单层培养结果相比较。方法：实验于2004—09／12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。选择2周龄健康雄性一级新西兰大白兔1只，体质量0．5kg。体外分离兔双侧股骨髁关节软骨细胞后行单层贴壁培养，细胞铺满单层后，分别将细胞悬液按2&;#215;10^6／L，2&;#215;10^7／L，2&;#215;10^8／L密度传代培养。选择生长状态良好的第2，3代细胞置于Ⅰ型胶原三维立体支架培养。分别通过相差倒置显微镜、流式细胞仪、电镜检查以及组织学染色及免疫组织化学染色，分析软骨细胞的表型、增殖速度等生物学性状变化情况。结果：①单层培养随着时间的延长，增殖速度逐渐减慢，第6代细胞增殖能力较第2代明显下降，出现树突状的细胞突起，表现出细胞老化的趋势。分泌Ⅱ型胶原的能力也逐渐减低，第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆内呈阳性反应，至第6代呈阴性。在以低密度传代培养时上述过程出现较快，而以高密度传代培养时软骨细胞形态改变延迟。②在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养时，软骨细胞大量增殖，能维持其细胞表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。扫描电镜观察到软骨细胞成团吸附于支架孔隙网壁，说明支架吸附性良好，与软骨细胞相容性好。结论：软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型，不能分泌Ⅱ型胶原，高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养，有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此，建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞，构建有功能的组织工程软骨。     

Ⅰ型胶原三维立体支架高密度培养软骨细胞的增殖及其分泌功能

目的:观察体外Ⅰ型胶原三维立体支架培养软骨细胞形态、增殖能力及Ⅱ型胶原表达的变化,并与单层培养结果相比较。方法:实验于2004-09/12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。选择2周龄健康雄性一级新西兰大白兔1只,体质量0.5kg。体外分离兔双侧股骨髁关节软骨细胞后行单层贴壁培养,细胞铺满单层后,分别将细胞悬液按2×106/L,2×107/L,2×108/L密度传代培养。选择生长状态良好的第2,3代细胞置于Ⅰ型胶原三维立体支架培养。分别通过相差倒置显微镜、流式细胞仪、电镜检查以及组织学染色及免疫组织化学染色,分析软骨细胞的表型、增殖速度等生物学性状变化情况。结果:①单层培养随着时间的延长,增殖速度逐渐减慢,第6代细胞增殖能力较第2代明显下降,出现树突状的细胞突起,表现出细胞老化的趋势。分泌Ⅱ型胶原的能力也逐渐减低,第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆内呈阳性反应,至第6代呈阴性。在以低密度传代培养时上述过程出现较快,而以高密度传代培养时软骨细胞形态改变延迟。②在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养时,软骨细胞大量增殖,能维持其细胞表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。扫描电镜观察到软骨细胞成团吸附于支架孔隙网壁,说明支架吸附性良好,与软骨细胞相容性好。结论:软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型,不能分泌Ⅱ型胶原,高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养,有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此,建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞,构建有功能的组织工程软骨。     

藻酸钙凝胶为载体体外短期培养羊软骨细胞的生物学性状

目的：观察以海藻酸钠为载体的成年羊软骨细胞移植前体外短期培养的生物学性状。方法：实验于2004-07／2005-11在解放军总医院骨科研究所完成。①取成年山羊关节软骨，酶消化法得到原代软骨细胞，体外培养扩增，选用培养的第2，3代羊关节软骨细胞与12g／L海藻酸钠混合，种植密度为2&;#215;10^9L^-1，将102mmol／L氯化钙溶液滴入软骨细胞藻酸钠悬液，形成藻酸钙软骨细胞凝胶，用软骨细胞培养液培养。②3，6，9，12d分别取凝胶，测定DNA、蛋白聚糖含量，并行苏木精-伊红、藩红花O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果：①藻酸钙凝胶中细胞的光镜形态学观察：软骨细胞在藻酸钙中呈丛状或球状生长，细胞在整个培养过程维持球形状态。②复合软骨细胞的藻酸钙凝胶的组织形态学及免疫组化测定结果：木精-伊红染色可见随培养时间的延长，细胞群增多变大；藩红花0染色显示软骨细胞周围存在不断增大的橙红染区，提示软骨细胞分泌蛋白聚糖含量持续增加。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③软骨细胞藻酸钙凝胶培养过程中DNA及蛋白聚糖含量的测定：随时间的延长，DNA的量逐渐增加，说明藻酸钙中的软骨细胞在不断增殖。藻酸钙中软骨细胞分泌的特异性基质蛋白聚糖随时间的延长而增多，象征着软骨细胞表型的稳定。结论：成年羊软骨细胞在藻酸钙中短期培养生长增殖良好，藻酸钙能保留羊软骨细胞表型，具备植入体内的条件。     

胰岛素样生长因子Ⅰ与转化生长因子β2对兔软骨细胞立体三维培养的作用

目的 检测胰岛素样生长因子Ⅰ （IGF-Ⅰ）、转化生长因子β2 （TGF-β2）单独及联合应用对立体培养软骨细胞增殖速度、细胞形态和表型、黏多糖含量及Ⅱ型胶原含量的影响.方法 取兔第二代软骨细胞于藻酸钙凝珠中,分别加入IGF-Ⅰ、TGF-β2及IGF-Ⅰ＋TGF F-β2进行立体培养.HE、甲苯胺蓝染色测软骨细胞形态、胞外基质变化;阿尔新蓝法测黏多糖;免疫组化法测Ⅱ型胶原及表型;Woessner法测Ⅱ型胶原含量.结果 细胞形态及表型的维持、增殖速度、黏多糖及Ⅱ型胶原含量,IGF-Ⅰ＋TGF-β2组明显优于其他组,各组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 IGF-Ⅰ与TGF-β2联合应用起协同作用,能够显著促进黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,促进软骨细胞外基质分泌及软骨细胞形态及表型的维持.     

海藻酸钠三维培养SW1353人软骨瘤细胞株:表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学特征及超微定位

背景:软骨细胞在体外单层培养的去分化改变及其来源困难是目前软骨细胞研究领域中的两大难题,目前关于SW1353人软骨瘤细胞表型和生物学特点及三维培养的相关报道较少.目的:观察SW1353人软骨瘤细胞在海藻酸钠三维培养体系中表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学及超微定位特点.设计、时间及地点:材料-细胞学体外观察,于2004-08/2006-01在中南大学湘雅医学院完成.材料:SW1353人软骨瘤细胞株由ATCC公司提供.方法:细胞复苏后接种,加入含胎牛血清、维生素C的DMEM培养基进行单层贴壁培养.离心后将细胞团块悬浮于低黏性海藻酸钠溶液中,细胞终浓度为2×10~9 L~(-1),滴入凝胶溶液,聚化获得细胞凝珠,每个凝珠约含20 000个细胞.藻酸盐凝胶三维体系培养8周后,柠檬酸钠分解凝胶,收获培养的软骨细胞及上清,并与单层培养的细胞进行比较.主要观察指标:细胞形态及表型变化,细胞生长曲线,细胞上清和海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达,细胞超微结构及Ⅱ型胶原的定位,同位素脉冲追踪活细胞Ⅱ型胶原的合成分泌.结果:①单层培养时,细胞由1周时的多角形变为8周后的条梭状或不规则形,三维培养条件下细胞形态始终以多角形为主.甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示,单层培养1周时均呈强阳性表达,8周后转为弱阳性,而三维培养8周后仍均呈强阳性表达.②三维培养条件下细胞生长曲线无明显增殖高峰,单层培养的细胞第8~10天达增殖高峰.③ELISA检测结果显示,单层培养8周后细胞上清中Ⅱ型胶原的表达明显高于第1周(P<0.05),同时也明显高于三维培养条件下细胞上清及海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达(P<0.05).④透射电镜下细胞超微结构基本正常,免疫电镜下可见细胞内Ⅱ型胶原主要定位于粗面内质网膜内,少数分布在线粒体.⑤~(14)C标记的脯氨酸干预后180 min,是细胞内合成及向细胞外分泌Ⅱ型胶原的高峰期.结论:SW1353人软骨瘤细胞在体外长期单层培养会发生细胞表型改变,其在藻酸盐凝胶三维培养体系中生长状态良好,细胞内软骨细胞标志物Ⅱ型胶原表达丰富,提示SW1353可以作为软骨细胞功能研究的良好模型.     

可注射性材料藻酸钠体外培养幼猪关节软骨细胞及形成组织工程化软骨的能力

目的:观察以藻酸钠为载体体外培养幼猪关节软骨细胞的增殖及形成工程化软骨的能力;评价藻酸钠凝胶作为培养软骨细胞载体的可行性。方法:实验于2003-10/2004-03在中山大学附属第二医院实验中心完成。取3个月龄小型猪膝关节软骨,酶消化法得到高纯度软骨细胞,体外培养3代后与藻酸钠混合,调节软骨细胞密度为5×109L-1,接种于96孔培养板中,每孔接种50μL,25g/L氯化钙溶液凝胶化10min后,DMEM培养基加体积分数为0.1的胎牛血清于96孔培养板中培养。4周后取材观察,行苏木精-伊红染色、Masson染色及免疫组织化学分析,观察软骨细胞形态,Ⅱ型胶原表达及成软骨能力。结果:①单层培养的软骨细胞呈多角形,细胞浆内表达Ⅱ型胶原;藻酸钠与软骨细胞复合后,藻酸钠凝胶材料与透明软骨细胞之间嵌合好。②苏木精-伊红染色见幼猪软骨细胞在海藻酸钠中增殖成株状或岛状;Masson染色见类似软骨陷窝之间胶原被染成绿色,可见细胞周围胶原分泌;免疫组织化学染色见细胞岛及其周围基质呈橘红色,细胞分泌Ⅱ型胶原较多。结论:幼猪软骨细胞在藻酸钠中可良好生长增殖,幼猪软骨细胞和藻酸钠复合可在体外成功构建组织工程化软骨。     

诱导转化人关节软骨细胞Ⅱ型胶原表型的有效方式

背量：诱导去分化软骨细胞重新表达Ⅱ型胶原主要基于软琼脂悬浮培养法。目的：用离心管聚集体培养(aggregate culture)诱导去分化转化人关节细胞的Ⅱ型胶原。设计：非随机非对照实验研究。地点和对象：实验在第三军医大学西南医院骨科完成，对象为转化人关节软骨细胞，美国Hyclone公司产品。干预：将体外长期培养韵第30，40，50代去分化转化软骨细胞消化后进行离心管培养，比较细胞在单层培养、离心管聚集体培养，以及在普通培养基，BAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白(BMP-2) 抗坏血酸盐 胰岛素]，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原的表达和胞外基质产生情况。主要观察指标：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原的免疫组化染色，Ⅱ型胶原的mRNA表达。结果：在单层培养条件下，去分化转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原，而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下该转化软骨细胞表达丰富的Ⅱ型胶原和大量胞外基质。结论：离心管聚集体培养和BAI诱导培养基是诱导去分化转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式。     

骨髓间充质干细胞出现软骨细胞表型后与壳聚糖/胶原三维多孔支架的复合培养

背景：体外单层诱导骨髓问充质干细胞转化为软骨细胞后，但仍存在难以长期扩增培养，容易出现去极化的现象。 目的：观察体外诱导骨髓间充质干细胞出现软骨细胞表型后，在自制复合壳聚糖，胶原三维多孔支架上构建组织工程化软骨的特点。 设计、时间及地点：以细胞为对象的单一样本观察，于2006—12／2007—09在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。 材料：1岁龄骨骼成熟的健康绵羊。雌雄不拘，体质量20～30kg。 方法：采用密度梯度离心法分离羊骨髓间充质干细胞，体外培养至第3代时，实验组以特定诱导液培养2周，以未经诱导培养的细胞为对照，两组均接种于自制的壳聚糖／胶原三维多孔支架中。 主要观察指标：在相差显微镜和扫描电镜下观察细胞形态、增殖和功能改变情况，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定形成软骨组织的特征。 结果：壳聚糖/胶原接种细胞悬液后，细胞迅速扩散到支架孔隙内，分布均匀，不易脱落，有较好的亲水性和黏附性。实验组细胞在三维立体诱导培养环境中，一直成球状聚集生长，生长旺盛，2周时肉眼即可隐约看见支架孔隙内的细胞团块，4周时则更加明显，甚至向支架表面外向生长。组织学检查发现诱导分化后的细胞分泌大量的细胞外基质，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性说明分泌的细胞外基质中含有软骨组织特有的Ⅱ型胶原，形成类似于正常软骨组织的组织工程化软骨。结论：在壳聚糖肢原三维立体诱导培养环境中，骨髓间充质干细胞能够很好的转化为软骨细胞，保持表型不变，继续增殖、代谢以及分泌细胞外基质，形成软骨组织。     

藻酸钙凝胶为载体体外短期培养羊软骨细胞的生物学性状

目的:观察以海藻酸钠为载体的成年羊软骨细胞移植前体外短期培养的生物学性状。方法:实验于2004-07/2005-11在解放军总医院骨科研究所完成。①取成年山羊关节软骨,酶消化法得到原代软骨细胞,体外培养扩增,选用培养的第2,3代羊关节软骨细胞与12g/L海藻酸钠混合,种植密度为2×109L-1,将102mmol/L氯化钙溶液滴入软骨细胞藻酸钠悬液,形成藻酸钙软骨细胞凝胶,用软骨细胞培养液培养。②3,6,912d,分别取凝胶,测定DNA、蛋白聚糖含量,并行苏木精-伊红、藩红花O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果:①藻酸钙凝胶中细胞的光镜形态学观察:软骨细胞在藻酸钙中呈丛状或球状生长,细胞在整个培养过程维持球形状态。②复合软骨细胞的藻酸钙凝胶的组织形态学及免疫组化测定结果:木精-伊红染色可见随培养时间的延长,细胞群增多变大;藩红花O染色显示软骨细胞周围存在不断增大的橙红染区,提示软骨细胞分泌蛋白聚糖含量持续增加。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③软骨细胞藻酸钙凝胶培养过程中DNA及蛋白聚糖含量的测定:随时间的延长,DNA的量逐渐增加,说明藻酸钙中的软骨细胞在不断增殖。藻酸钙中软骨细胞分泌的特异性基质蛋白聚糖随时间的延长而增多,象征着软骨细胞表型的稳定。结论:成年羊软骨细胞在藻酸钙中短期培养生长增殖良好,藻酸钙能保留羊软骨细胞表型,具备植入体内的条件。     

地塞米松磷酸钠对体外培养关节软骨细胞增殖的影响

背景:研究表明,地塞米松可以使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少,Ⅰ型胶原增多,但糖皮质激素对关节软骨细胞增殖作用的机制尚不十分清楚.目的:验证地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞增殖的影响.设计:对比观察.材料: 1月龄新西兰白兔用于软骨细胞的分离与培养.方法:兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同质量浓度地塞米松磷酸钠(0.02,0.1,0.5 g/L)的DMEM培养液.主要观察指标:①原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察.②应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原能力.③透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化.结果:实验组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢.各实验组Ⅱ型胶原平均灰度值均显著高于对照组(P<0.05).实验组软骨细胞进入S期、G_2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G_0/G_1期的细胞比率增加.电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少.结论:地塞米松磷酸钠抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白的合成能力有关.     

成年兔关节软骨创伤模型中软骨细胞的分离及体外培养观察

目的观察成年兔关节软骨损伤模型中能获得的关节软骨和软骨细胞数量,探讨不同浓度的Ⅱ型胶原酶在不同时间段分离软骨细胞的能力及体外培养所获得的软骨细胞的生物学活性。方法建立成年兔关节软骨损伤模型,用0.1%~0.2%Ⅱ型胶原酶消化4小时,每小时收集消化下来的兔膝关节软骨细胞,计数细胞收获率和细胞存活率。体外培养原代及传代细胞,观察细胞形态和生长规律,绘制生长曲线,检测细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白多糖能力。结果成年兔膝关节软骨细胞的收获率平均为3603.6×104个/克,细胞存活率平均为97.3%,胶原酶浓度与细胞的获取率无显著关系,但与细胞的存活率相关,在消化时间超过3h后细胞的存活率显著降低,在培养过程中出现易老化现象,原代细胞贴壁时间为48~72h,甲苯胺蓝异染反应较强,Ⅱ型胶原免疫组化染色反应呈强阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色为阴性,传3代细胞形态由卵圆形、多角形变为梭形,甲苯胺蓝染色异染反应较弱,免疫组化Ⅰ型胶原为强阳性而Ⅱ型胶原表达极弱。结论0.1~0.2%Ⅱ型胶原酶消化、分批收取细胞具有较高的细胞收获率和存活率,体外培养时,从创伤后关节软骨中获得的原代细胞和1代细胞具有良好的软骨表型,第3代及以后的细胞生物学活性低下。     

自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景：目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。目的：比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。方法：兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。结果与结论：①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）;在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。     

结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响

背景:在关节软骨损伤修复的过程中,由于目前实验室中常用的细胞因子存在半衰期短、价格昂贵等缺点,不能广泛应用于临床.目的:假设结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型有一定的影响,为组织学方法修复关节软骨缺损寻找新的细胞因子.设计、时间及地点:随机区组设计对照实验,于2007-08/2008-02在深圳龙岗中心医院完成.材料:健康1月龄新西兰大白兔2只:结缔组织生长因子为Propetech公司产品.方法:获取兔关节软骨组织,将其剪碎,Ⅱ型胶原酶消化法原代分离培养兔关节软骨细胞,待细胞铺满瓶底80%胰酶消化传代,取其第2代,细胞贴壁后随机分组,实验组分别加入30,50,100,150 μ g/L的结缔组织生长因子,对照组仅加入DMEM培养液进行体外培养.主要观察指标:采用倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量改变,采用四唑盐(MTT)法检测不同浓度的结缔组织生长因子对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学法(SABC法)检测Ⅱ型胶原的表达情况.结果:①结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞生长迅速,呈典型的软骨细胞形态,部分细胞聚集成团,形成软骨结节.②结缔组织生长因子能显著促进兔关节软骨细胞增殖,与对照组相比差异具有显著性意义(P<0.01).不同质量浓度的结缔组织生长因子均能促软骨细胞增殖,100μg/L为最佳作用质量浓度(P<0.01).③结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达增多,且始终为阳性.结论:结缔组织生长因子可以刺激体外培养的兔关节软骨细胞增殖,促进软骨特异性Ⅱ型胶原表达,维持软骨表型.结缔组织生长因子可能用来作为组织工程学修复软骨缺损,治疗骨关节炎的新的生长因子.     

异种关节软骨与MSCs体外共同培养的实验研究

目的提供一种新的种子细胞获得方法,解决软骨缺损修复过程中软骨数量不足的困难。方法人骨髓间充质干细胞体外扩增诱导分化后与兔的关节软骨细胞按不同比例共同培养利用real-time PCR技术分析细胞表型的表达情况。结果实验组2种细胞共培养4周后,混合培养显示正反馈调节软骨细胞的增殖,软骨细胞外基质、SOX9、Ⅱ型胶原基因表达增加,软骨细胞生成明显增加。结论间充质干细胞以旁分泌或自分泌的方式调节间充质干细胞向软骨细胞的转化。     

异种关节软骨与MSCs体外共同培养的实验研究

目的提供一种新的种子细胞获得方法,解决软骨缺损修复过程中软骨数量不足的困难。方法人骨髓间充质干细胞体外扩增诱导分化后与兔的关节软骨细胞按不同比例共同培养利用real-time PCR技术分析细胞表型的表达情况。结果实验组2种细胞共培养4周后,混合培养显示正反馈调节软骨细胞的增殖,软骨细胞外基质、SOX9、Ⅱ型胶原基因表达增加,软骨细胞生成明显增加。结论间充质干细胞以旁分泌或自分泌的方式调节间充质干细胞向软骨细胞的转化。     

软骨细胞形态、表型与胞间通讯的研究

背景：在体外培养时软骨细胞会像成纤维细胞样成片生长并失去表型，软骨细胞胞间通讯与细胞表型的关系尚无报告。目的：了解体外培养的不同形态的软骨细胞的增殖、基质合成、荧光染料摄入以及缝隙连接的关系。设计：以诊断为依据的实验研究。地点和对象：实验在解放军总医院骨科研究所和基础研究所完成，实验对象为兔关节软骨细胞，人股骨头软骨。干预：体外培养的兔软骨细胞，分别进行苏木精一伊红(HE)、亮绿一藩红花O染色，显微镜下测量细胞大小、激光共聚焦显微镜下测量细胞内的荧光强度。激光淬灭软骨细胞内的荧光染料。主要观察指标：软骨细胞的外观、细胞大小、细胞内的荧光强度。结果：细胞投影面积测量：软骨细胞变大，失去球形外观后增殖加快，平均面积1755．1μm^2，投影面积差别可达50倍。基质合成消失，缝隙连接消失。显微镜下软骨细胞的荧光强度测量：球形软骨细胞CFDA-AM摄人多，(平均2057／30个细胞)，扁平细胞摄入少(平均83／30个细胞)。体外培养的球形兔软骨细胞间，人关节软骨生发层陷窝内的细胞间有胞间通讯。结论：软骨细胞的密度、形态、表型和缝隙连接之间有一定的关系。而细胞外形可能决定细胞的表型。