依达拉奉对氯胺酮致PC12细胞凋亡时线粒体功能的影响

目的评价依达拉奉对氯胺酮致PC12细胞损伤时线粒体功能的影响。方法将神经生长因子诱导分化的PC12细胞采用随机数字表法分为3组(n=30):对照组PC12细胞正常培养;氯胺酮组PC12细胞诱导分化后第7天加入PBS+100 μmol/L氯胺酮培养;依达拉奉+氯胺酮组加入10 μmol/L依达拉奉+100 μmol/L氯胺酮培养。于培养24 h时采用试剂盒测定细胞活力、caspase-3/7活性、ROS活性、ATP含量和NADH/NAD+比例, TUNEL法观察细胞凋亡情况, 计算细胞凋亡率。结果与对照组比较, 氯胺酮组和依达拉奉+氯胺酮组细胞活力、caspase-3/7活性、NADH/NAD+比例和细胞凋亡率升高, ROS活性和ATP含量降低(P<0.05);与氯胺酮组比较, 依达拉奉+氯胺酮组细胞活力、caspase-3/7活性、NADH/NAD+比例和细胞凋亡率降低, ROS活性和ATP含量升高(P<0.05)。结论依达拉奉抑制氯胺酮致PC12细胞凋亡的机制与其改善线粒体功能有关。     

氯胺酮和咪达唑仑对谷氨酸致大鼠神经元样PC12细胞损伤的作用

目的 探讨氯胺酮和咪达唑仑对谷氨酸致大鼠神经元样PC12细胞损伤的作用。方法 培养6-7d的神经元样PC12细胞接种于培养板培养18h后随机分为正常对照组（C组），谷氨酸组（G组），0．1、0．5、1．0mmol／L氯胺酮组（K1组-K3组），1、5、10、25、50μmol／L咪达唑仑组（M1组～M5组），0．1、0．5、1．0mmol／L氯胺酮混合10μmol／L咪达唑仑组（KM1组-KM3组）。应用MTT比色法和乳酸脱氢酶（LDH）活性检测评估细胞活力及细胞损伤程度；RT-PCR法测定c-fos mRNA表达水平；细胞免疫组化法测定Fos蛋白表达水平。结果 （1）与C组比较，除K3组外，其余各组细胞活力均降低（P〈0．05）；与G组比较，K1组。K3组、M1组-15组细胞活力均增强（P〈0．05或0．01），LDH漏出率均降低（P〈0．01）；与K1组比较，KM1组细胞活力增加，LDH漏出率降低（P〈0．05）；KM2组与K2组比较，细胞活力、LDH漏出率无明显差异（P〉0．05）。与K3组比较，KM3组细胞活力降低，LDH漏出率升高（P〈0．01）。（2）与C组比较，除K3组外，其余各组c-fos mRNA的表达均上调（P〈0．05）。与G组比较，K1组-K3组、M3组、KM2组c-fos mRNA的表达均下调（P〈0．05）；与K2组、M3组比较，KM2组c-fos mRNA的表达上调（P〈0．05）。（3）与C组比较，除K3组外，其余各组Fos染色阳性胞核数目增加，平均光密度值升高（P〈0．01）。与G组比较，K1组-K3组、M3组、KM2组Fos染色阳性胞核数减少，平均光密度值降低（P〈0．05或0．01）。与K2组、M3组比较，KM2组Fos染色阳性胞核数增加（P〈0．05），平均光密度值升高（P〈0．05）。结论 氯胺酮对谷氨酸损伤的神经元样PC12细胞具有剂量依赖性的保护作用，咪达唑仑也有神经保护作用；低剂量氯胺酮和咪达唑仑混合对神经的保护作用增强，而高剂量氯胺酮和咪达唑仑有对抗作用。     

氯胺酮预给药对体外谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响

目的探讨氯胺酮预给药对谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的作用及信号转导机制。方法将原代培养的大鼠CGNs随机分为8组:C组:培养基中不加药液;G组:培养基中加入300 μmol/L谷氨酸;K1、K2、K3组:培养基中分别加入10、100、1 000μmol/L氯胺酮预先孵育1 h 后,再加入谷氨酸;LK3组:培养基中加入20μmol/L Ly294002,30min后加入1 000μmol/L.氯胺酮,1 h后加入谷氨酸;L组:培养基中加入Ly294002;LG组:培养基中加入Ly294002,30 min后加入谷氨酸。20 h后,用相差显微镜观察神经元形态学,Hoechst33258核染色后,观察凋亡CGNs;提取DNA行琼脂糖凝胶电泳分析,二乙酸荧光素染色法测定CGNs的存活率。结果谷氨酸可诱导大鼠CGNs凋亡。CGNs 存活率:与G组比较,C组、K1、K2、K3、L组升高幅度下降(P<0.05),LG组差异无统计学意义;C组与L组比较差异无统计学意义;LK3组低于K3组(P<0.01)。CGNs存活率(Y)与氯胺酮浓度(X)呈线性回归,回归方程为Y=0.202logX 0.2596,r3=0.919(P<0.01)。结论氯胺酮剂量依赖性地抑制谷氨酸诱导大鼠CGNs的凋亡,而PI3-K/AKT信号转导通路可能参与了其抗神经元凋亡作用。     

异丙酚对谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的影响

目的观察异丙酚对谷氨酸诱导体外培养大鼠海马神经元损伤的影响。方法酶消化法分离Wistar新生大鼠海马,培养12 d的海马神经元随机分为三组(n=5),正常对照组(Con组)、谷氨酸100 μmol/L孵育24 h组(Glu组)、谷氨酸100 μmol/L孵育24 h后异丙酚500 μmol/L再孵育24 h组 (Pro-Glu组)。四甲基氮唑蓝法测定细胞存活率,免疫细胞化学法测定c-fos蛋白表达,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果与Con组比较,Glu组及Pro-Glu组的细胞存活率下降,c-fos蛋白在细胞核内表达呈紫黑色且数量增加,细胞凋亡率增高(P<0．05或0．01);与Glu组比较,Pro-Glu组c-fos阳性蛋白减少,细胞凋亡率降低,细胞存活率增高(P<0．05)。结论异丙酚通过降低细胞凋亡率和c-fos阳性蛋白表达,提高细胞存活率,对谷氨酸诱导的海马神经元损伤起一定保护作用。     

氯胺酮对谷氨酸引起神经元样嗜铬细胞瘤细胞株凋亡的影响

目的 观察氯胺酮对谷氨酸引起神经元样嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株凋亡的影响。方法PC12细胞株分别以2×103/孔和1×105/ml密度接种于96孔细胞培养板和60 mm细胞培养皿中,置于培养基,培养基中加10 nmol/L神经生长因子(7S-NGF),96孔细胞培养板和60 mm细胞培养皿的细胞均随机分为五组,A组暴露于20 mmol/L谷氨酸中,B组暴露于20 mmol/L谷氨酸 0.1 mmol/L氯胺酮(氯胺酮比谷氨酸提前1 min 加入)中,C组暴露于20 mmol/L 谷氨酸 1.0 mmol/L氯胺酮中,D组暴露于20 mmol/L 谷氨酸 100 μmol/L D-2-氨基-5-膦酸基戊酸(D-AP5)(细胞与D-AP5提前孵育2h)中,E组暴露于等容积的不含7S-NGF的新鲜培养液中,采用MTT法测定细胞培养板中PC细胞的细胞活力,采用死端比色TUNEL系统细胞检测培养皿中PC12细胞株的凋亡率。结果 A组、B组、C组和D组细胞活力分别为:37％±6％、65％±7％、99％±10％、90％±22％,与A组比较,B组、C组、D组细胞活力均升高(P<0.05或0.01)。A组、C组、D组、E组凋亡细胞率分别为66％±10％、20％±6％、22±7％、3.2％±1.8％,与A组比较,C组、D组、E组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。结论 氯胺酮通过抑制谷氨酸引起的神经元样PC12细胞株凋亡而发挥神经保护作用。     

咪达唑仑对新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡的影响

目的 探讨咪达唑仑对新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡的影响.方法 分离、培养出生2～4 d的Wistar大鼠心肌细胞,将培养融合的心肌细胞随机分为7组(n=7):正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(HR组)、外周型苯二氮革类受体(PBR)拮抗剂PK 11195组(P组)、PBR激动剂Ro 5-4864组(R组)、咪达唑仑组(M组)、PK 11195+Ro 5-4864组(PR组)和PK 11195+咪达唑仑组(PM组).HR组缺氧30 min复氧2 h建立缺氧/复氧模型.P组、R组、M组、PR组、PM组在培养皿中分别加入终浓度为10-4mol/L的PK 11195、Ro 5-4864和咪达唑仑及相应混合药物共同孵育,30 min后行缺氧/复氧.复氧2 h时收集细胞,采用HTC-Annexin V/PI双标法检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数(AI);Western blot法测定心肌细胞蛋白激酶C(PKc)表达水平;Meta Flour单细胞内钙测定系统测定细胞内钙离子浓度.结果 与C组比较,其余各组AI升高,除R组外其余各组细胞内钙离子浓度升高,PKC表达下调(P<0.01);与HR组比较,R组AI和细胞内钙离子浓度降低,PKC表达上调,M组和PM组AI降低(P<0.01);与P组比较,R组AI和细胞内钙离子浓度降低,PKC表达上调(P<0.01),PR组、PM组差异无统计学意义(P>0.05);与R组比较,M组、PR组、PM组Al和细胞内钙离子浓度均升高,PKC表达下调(P<0.01).结论 咪达唑仑10-4mol/L可减轻新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡,其作用机制可能是非PBR依赖性的,且与细胞内钙离子浓度和PKC表达无关.     

不同浓度氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞凋亡的影响

目的观察不同浓度氯胺酮对谷氨酸诱导的大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞凋亡的影响。方法取出生1-3 d Wistar大鼠T11-L5脊髓背角神经元和星形胶质细胞,原代混合培养2 周。将细胞随机分为6组(n=8):对照组(C组)加入Hanks液;谷氨酸组(G组)加入谷氨酸至终浓度100μmol/L;氯胺酮组(K组)加入氯胺酮至终浓度1 mmol/L;GK1、GK2、GK3组先加入谷氨酸至终浓度100μmol/L,30min后分别加入氯胺酮至终浓度0.1、1、10mmol/L。培养48 h后取各组细胞上清液检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度,瑞氏染色观察细胞形态变化,流式细胞仪检测神经元和星形胶质细胞凋亡。结果与C组比较,G、GK1、GK2组神经元和星形胶质细胞凋亡峰值增加,GK3组细胞几乎全部死亡,未能上机检测细胞凋亡,G、GK1、GK2、GK3组IL-1β和TNF-α浓度升高(P<0.01)。与G组比较,GK2组各指标均降低,GK,组IL-1β和TNF-α浓度升高(P<0.01)。结论1 mmol/L氯胺酮可降低谷氨酸引起大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞的凋亡。     

右美托咪定对咪达唑仑所致神经干细胞增殖、分化和凋亡改变的影响

目的 研究咪达唑仑对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖、分化及凋亡的毒性作用及右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)能否缓解咪达唑仑的神经毒性作用. 方法 分离培养孕14～15 d大鼠胚胎大脑皮质NSCs,将NSCs接种于培养板中,培养24 h后,将其按照完全随机分组法分为3组:对照组(C组)、咪达唑仑组(M组)、Dex联合咪达唑仑组(M+D组).分别采用咪达唑仑、Dex联合咪达唑仑处理培养的第一、二代NSCs 24 h,采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)]比色法检测细胞活力,溴脱氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)掺入法检测细胞增殖,免疫细胞化学法观察NSCs分化情况,原位末端标记法(terminal dUTP nick-end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡. 结果 与对照组比较,咪达唑仑干预NSCs 24 h可降低细胞活力(对照组0.214±0.006,咪达唑仑组0.187±0.002)、减少细胞增殖[(对照组(35.7±1.0)％,咪达唑仑组(27.6±1.0)％]、增加细胞凋亡[对照组(5.7±0.8)％,咪达唑仑组(7.8±1.1)％](P＜0.01),但对NSCs分化没有显著影响(P＞0.05);与咪达唑仑处理比较,Dex联合咪达唑仑干预NSCs 24 h,可增加细胞活力[M+D组0.233±0.007]和细胞增殖[M+D组(35.7±1.1)％]、减少细胞凋亡[M+D组(5.3±1.0)％](P＜0.01),但对NSCs向神经元和星形胶质细胞分化无明显影响(P＞0.05). 结论 Dex可缓解咪达唑仑抑制NSCs增殖、促进细胞凋亡的作用,但不影响其向神经元和星形胶质细胞方向分化.     

维生素B1介导的Akt/mTOR/STAT3信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞损伤中的作用

[目的]研究维生素B1(thiamine,VitB1)介导的Akt/mTOR/STAT3信号通路在谷氨酸(glutamate,Glu)诱导的PC12细胞损伤中的作用.[方法]应用MTT法检测不同浓度谷氨酸对PC12细胞作用不同时间的细胞生长抑制率,筛选出合适的作用浓度与作用时间后,将细胞分为4组,分别为A组:正常对照组;B组:20 mmoL/L谷氨酸处理组;C组:20 mmol/L谷氨酸+300 μmol/L维生素B1处理组;D组:20 mmol/L谷氨酸+300 μmol/L维生素B1+ 800 nmol/L雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理组.应用流式细胞术观察各组作用12 h后细胞凋亡率,Western blot观察各组处理1、4、8、12 h后,p-Akt,p-mTOR,p-STAT3蛋白表达情况.[结果](1)谷氨酸对PC12细胞的生长抑制作用随作用时间和作用浓度的增加而增强;(2)A组的凋亡率为(3.42±0.79)％;C组凋亡率为(23.85±1.58)％,明显低于B组(40.20±2.54)％和D组(53.49±2.83)％(P＜0.01);(3) Western blot 检测结果表明C组各时间点p-Akt,p-mTOR,p-STAT3表达均高于A、B、D组,并且p-Akt表达量在1h时最高,p-mTOR和p-STAT3在4h时达到高峰.[结论]维生素B1激活了细胞Akt/mTOR/STAT3信号通路,该通路对谷氨酸诱导的神经细胞损伤起到了保护作用.     

咪达唑仑对大鼠背根神经节神经元GABAA受体激活电流的影响

目的 咪达唑仑对大鼠背根神经节(DRG)神经元GABAA受体激活电流的影响.方法 健康SD大鼠,体重200 ～ 250 g,4周龄,雌雄不拘,分离DRG神经元,采用全细胞膜片钳技术记录GABAA受体激活电流.采用无糖细胞外液进行药物配制.记录咪达唑仑(终浓度3.00 μmol/L,)与不同浓度(终浓度0.03、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L) GABA混合液作用下的GABAA受体激活电流、不同浓度(终浓度0.03、0.10、1.00、3.00、10.00、100.00 μmol/L)咪达唑仑作用下的GABAA受体激活电流、不同浓度(终浓度0.03、0.10、1.00、3.00、10.00、100.00 μmol/L)咪达唑仑与GABA(终浓度100.00 μmol/L)混合液作用下的GABAA受体激活电流和不同咪达唑仑预灌注时间(灌注即刻、20、40、60、120 s)时咪达唑仑(终浓度1.00 μmol/L)与GABA(终浓度100.00 μmol/L)混合液作用下的GABAA受体激活电流.计算咪达唑仑·给药前后电流的增强率.结果 对GABA敏感的神经元灌注咪达唑仑均未记录到可检测的膜电流变化;各浓度GABA下,咪达唑仑给药后GABAA受体激活电流均较给药前增强(P＜0.01);各浓度咪达唑仑给药后DRG神经元GABAA受体激活电流均较给药前增强,且随咪达唑仑浓度升高,对DRG神经元GABAA受体激活电流的增强率逐渐升高,咪达唑仑3.00 μmol/L时达峰值(P ＜0.05或0.01);随咪达唑仑预灌流时间延长,DRG神经元GABAA受体激活电流增强率逐渐升高,预灌流40 s时达峰值(β＜0.05或0.01).结论 咪达唑仑可增强DRG神经元GABAA受体激活电流,提示咪达唑仑可通过增强GABAA受体活性,从而增强GABA的作用,在脊髓水平产生镇痛作用.     

异氟醚预处理对谷氨酸诱导大鼠神经元样PC12细胞凋亡的影响

目的 探讨异氟醚预处理对谷氨酸诱导大鼠神经元样PC12细胞凋亡的影响.方法 神经生长因子孵育5d的神经元样PC12细胞,以5×104个/ml密度接种于6 cm培养皿(3 ml/皿)或6孔板(2ml/孔),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=18):正常对照组(C组)、谷氨酸组(G组)、谷氨酸+异氟醚组(GI组)和谷氨酸+异氟醚+三磷酸肌醇受体拮抗剂光溜海绵素组(GIX组).C组不做任何处理;G组、GI组和GIX组均加入500 μmol/L谷氨酸,GI组和GIX组通入1.2％异氟醚2h,停止通入后10 min加入谷氨酸,GIX组通入异氟醚前即刻加入光溜海绵素100 nmol/L.于谷氨酸孵育20 min时,每组取6皿和6孔,收集细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位(MMP),采用显微荧光测量技术检测细胞内钙离子浓度([Ca2+]i).结果 与C组比较,G组和GIX组细胞凋亡率和[Ca2+]i升高,MMP降低(P＜0.01),GI组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与G组比较,GI组和GIX组细胞凋亡率和[Ca2+]i降低,MMP升高(P＜0.05或0.01);与GI组比较,GIX组细胞凋亡率和[Ca2+]i升高,MMP降低(P＜0.01).结论 异氟醚预处理可抑制大鼠神经元样PC12细胞凋亡,其机制与激活内质网三磷酸肌醇受体,抑制内质网释放Ca2+,提高MMP有关.     

异丙酚对布比卡因致PC12细胞毒性时细胞Ca2+浓度和一氧化氮合酶活性的影响

目的 评价异丙酚对布比卡因致PC12细胞毒性时细胞Ca2+浓度和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响.方法 PC12细胞悬液(105/ml)随机分成4组:对照组(C组)、异丙酚组(P组)、布比卡因组(B组)和异丙酚+布比卡因组(PB组),每组PC12细胞分别接种于36孔板(每孔1 ml,每组9孔)、激光共聚焦显微镜专用培养皿(每皿1 ml,每组6皿)和24孔板(每孔 1 ml,每组6孔).C组加入D-Hank液500 μl;P组加入异丙酚至终浓度为2 mmol/L;B组加入布比卡因至终浓度为0.09 mmol/L;PB组同时加入异丙酚和布比卡因,终浓度分别为2 mmol/L和0.09 mmol/L.于36孔板中孵育24 h后测定PC12细胞凋亡率;于激光共聚焦显微镜专用培养皿中孵育6、24 h时,测定PC12细胞游离Ca2+浓度;于24孔板中孵育6、24 h时测定细胞NOS活性.结果 与C组相比,B组和PB组PC12细胞游离Ca2+浓度、NOS活性和凋亡率均升高(P<0.01),P组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);与B组相比,PB组PC12细胞游离Ca2+浓度、NOS活性和凋亡率均降低(P<0.05).结论 在细胞水平,异祆丙酚可能通过抑制NOS活性和钙超载,减轻布比卡因诱导的神经毒性.     

依托咪酯对猪肾上腺皮质细胞的毒性作用及依托咪酯预处理对其的影响

目的 探讨依托咪酯对猪肾上腺皮质细胞的毒性作用及依托咪酯预处理对其的影响.方法 实验分两部分,第一部分为细胞毒性实验,猪肾上腺皮质细胞随机分为8组,每组3皿,对照组加入0.5%二甲基亚砜(DMSO),其他7组分别加入50、100、200、300、400、500、1000 μmol/L依托咪酯,每组分别作用6、12、24 h,进行下述指标检测.第二部分为预处理实验,猪肾上腺皮质细胞随机分为3组,每组3皿,对照组加入0.5%DMSO,损伤组加入325 μmol/L依托咪酯作用24 h,预处理组先加入0.6 μmol/L依托咪酯作用1 h,洗脱后在培养基中孵育4 h,再加入325 μmol/L依托咪酯作用24 h.采用CCK-8法检测细胞活力,计算24 h时依托咪酯半数抑制浓度(IC50),采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 依托咪酯可抑制猪肾上腺皮质细胞活力,诱导细胞凋亡,呈浓度和时间依赖性,24 h时IC50为325μmol/L.0.6 μmol/L依托咪酯预处理1 h可抑制325μmol/L依托咪酯诱发的细胞凋亡具有抑制作用.结论 依托咪酯通过诱发猪肾上腺皮质细胞凋亡对其功能产生抑制作用;依托咪酯预处理可减轻药物自身引起的这种抑制作用.     

T-型钙通道在利多卡因致神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤中的作用

目的 探讨T-型钙通道在利多卡因致神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤中的作用.方法 SH-SY5Y细胞离体培养后,采用随机数字表法,将SH-SY5Y细胞随机分为4组,每组66孔,正常对照组(C组):SH-SY5Y细胞继续培养24 h;米贝地尔+SH-SY5Y细胞组(M组):培养液中加入T-型钙通道阻断剂米贝地尔,终浓度5 μmol/L,孵育24 h;利多卡因+SH-SY5Y细胞组(L组):培养液中加入利多卡因,终浓度10 mmol/L,孵育24 h;米贝地尔+利多卡因+SH-SYSY细胞组(ML组):培养液中加入米贝地尔和利多卡因,终浓度分别为5 μmol/L、10 mmol/L,孵育24 h.于开始培养或孵育时(T0)、培养或孵育1、6、12和24 h时测定SH-SY5Y细胞活力和凋亡率,孵育24 h时观察SH-SY5Y细胞形态学.结果 与C组比较,L组和ML组SH-SY5Y细胞活力降低,凋亡率升高(P＜0.05),M组差异无统计学意义(P＞0.05);与M组比较,L组和ML组SH-SY5Y细胞活力降低,凋亡率升高(P＜0.05);与L组比较,ML组SH-SYSY细胞活力升高,凋亡率降低(P＜0.05).L组SH-SY5Y细胞形态学发生改变,ML组SH-SY5Y细胞形态学改变较L组减轻.结论 T-型钙通道参与了利多卡因导致的神经细胞损伤.

Abstract：

Objective To investigate the role of T-type calcium channel in lidocaine-induced neuronal cytotoxicity . Methods SH-SYSY cell line was a gift from cell biology laboratory of our medical university. The cells were cultured in DMEM liquid culture medium at 37℃ in incubator filled with 5% CO2 , and randomly divided into 4 groups ( n = 66 each) : control group (group C)and M, L and ML groups were exposed to 5 μmol/L mibefradil (a T-type calcium channel blocker), 10 mmol/L lidocaine and 5 μmoL/L mibefradil + 10 mmol/L lidocaine for 24 h. Cell morphology was examined by electronic microscopy at 24 h of drug exposure. Cell viability (by MTT) and neuronal apoptosis (by flow cytometry) were detected immediately before and at 1, 6, 12 and 24 h of exposure to mibefradil or/and lidocaine.Results In C and M groups, the cells demonstrated dendritic protrusions, enlarged nerve processes and dense lattice. After being exposed to lidocaine for 24 h, the dendritic protrusions disappeared,the cells decreased in size, shrinked and became round; the cell viability was significantly decreased while the neuronal apoptosis increased. The lidocaine-induced changes were significantly attenuated by co-incubation with mibefradil. ConclusionT-type calcium channel is involved in lidocaine-induced neuronal cytotoxicity.     

ROS/GADD153蛋白在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨活性氧簇(ROS)/GADD153蛋白在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞凋亡中的作用.方法 体外培养乳鼠心肌细胞,随机分为9组(n=5),Ⅰ组(C组)常规心肌细胞培养,不予其他处理;Ⅱ组(AngⅡ6组)给予100 nmol/L AngⅡ,孵育6 h;Ⅲ组(AnsⅡ12组)给予100 nmol/L AngⅡ,孵育12 h;Ⅳ组(ArtsⅡ24组)给予100 nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;V组[N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)+AngⅡ组]预先给予抗氧化剂NAC 5 mmol/L,2 h后给予100 nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;Ⅵ组(NAC组)仅给予NAC 5 mmol/L,孵育24 h;Ⅶ组(anti-ODN组)GADD153反义寡核苷酸10 μmol/L转染24 h后,加入100nmoFL AngⅡ,孵育24 h;Ⅷ组(mis-ODN组)GADDl53错义寡核苷酸10 μmol/L转染24 h后,加入100nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;Ⅸ组(脂质体对照组)加入等容量转染试剂,孵育24 h.检测细胞活力、细胞内ROS产量、细胞凋亡率及GADD153蛋白表达水平.结果 与C组相比,AngⅡ6组、AngⅡ12组、AngⅡ24组细胞活力降低,细胞凋亡率、ROS产量及GADD153蛋白表达升高,且呈时间依赖性(P＜0.05);与AngⅡ24组比较,NAC+AngⅡ组和anti-ODN组细胞活力升高,细胞凋亡率、ROS产量及GADD153蛋白表达降低(P＜0.05).结论 AugⅡ通过增加ROS产量,诱导GADD153蛋白表达上调,从而导致心肌细胞凋亡的发生.     

NF-κB在氯胺酮诱导大鼠原代培养大脑皮层神经元凋亡中的作用

目的 评价NF-κB在氯胺酮诱导大鼠原代培养大脑皮层神经元凋亡中的作用.方法 体外培养6 d的大鼠大脑皮层神经元15孔,随机分为3组(n=5):对照组(C组)正常培养;氯胺酮组(K组)和氯胺酮+NF-κB抑制剂SN50组(KS组)分别加入1 mmol/L氯胺酮、1 mmol/L氯胺酮+2.5 μmol/L SN50,作用24 h.洗脱后24 h时采用凝胶迁移实验检测神经元NF-κB活性,采用Westernblot法测定凋亡相关蛋白Bcl-XL和Bax的表达,计算Bcl-XL/Bax,计数凋亡神经元,电镜下观察神经元的超微结构.结果 与C组相比,K组NF-κB活性、Bcl-XL/Bax、神经元凋亡率升高(P＜0.05),KS组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与K组相比,KS组NF-κB活性、Bcl-XL/Bax、神经元凋亡率降低(P＜0.05).电镜结果显示:KS组神经元损伤较K组明显减轻.结论 NF-κB参与了氯胺酮诱导大鼠原代培养大脑皮层神经元凋亡的过程.     

异丙酚对β-淀粉样蛋白诱导大鼠皮层神经元损伤的影响

目的 探讨异丙酚对β-淀粉样蛋白(β-AP)诱导大鼠皮层神经元损伤的影响.方法 孕18 dSD大鼠,体外分离皮层神经元,5×104个/孔,每孔200μl接种于96孔培养板上,培养7 d.实验一:取15孔神经元随机分为5组(n=3):对照组;损伤组;异丙酚预防给药Ⅰ组加入β-AP 25μmol/L前24 h加入异丙酚50μmol/L,再孵育24h;异丙酚预防给药Ⅱ组同时加入异丙酚50 μmol/L和β-AP 25μmol/L,孵育24 h;异丙酚治疗给药组加入β-AP 25μmol/L后6 h,加入异丙酚50μmol/L,再孵育18 h.实验二:取18孔神经元随机分为6组(n=3):对照组;损伤组;脂肪乳剂组加入β-AP 25μmol/L后6 h,加入等容量10%脂肪乳剂,再孵育18 h;不同浓度异丙酚组加入β-AP 25μmol/L后6 h,分别加入异丙酚1、10、50 βmol/L,再孵育18 h.测定神经元乳酸脱氢酶(LDH)释放量和神经元活力.采用TUNEL法、Hoechst33342染色观察细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率.结果 实验一:与损伤组比较,异丙酚预防给药组LDH释放量差异无统计学意义(P＞0.05),异丙酚治疗给药组神经元LDH释放量减少(P＜0.05).实验二:与损伤组比较,异丙酚50μmol/L组神经元LDH释放量减少,神经元活力升高,细胞凋亡率降低(P＜0.05).结论 异丙酚50 μmol/L治疗性给药可减轻β-淀粉样蛋白诱导大鼠皮层神经元损伤,预防性给药对其无影响.     

NF-κB、Caspase-3在腺苷诱导人HepG2细胞凋亡中的作用

目的 研究NF-κB、Caspase-3在腺苷(ADO)体外诱导人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用.方法 将不同浓度的ADO(0.1～5 mmol/L)作用于HepG2细胞,采用MTT法测定ADO抑制细胞增殖的时间效应和剂量效应.2.0 mmol/L ADO单用或联合NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC,100 μmol/L)作用HepG2细胞12 h、24 h,采用Hoechst 33342荧光染色法及流式细胞术(FCM)观察细胞凋亡及细胞周期,Western blot技术检测NF-κB蛋白表达;荧光比色法测定Caspase-3酶活性.结果 ADO对HepG2细胞生长具有显著抑制作用,并呈一定的量效和时效关系.药物作用24 h、48 h的IC50分别为2.52 mmol/L和1.89 mmol/L.ADO单独处理HepG2细胞12 h和24 h或联合PDTC处理后,细胞凋亡率分别为8.30%、22.32%;20.18%、30.89%,均显著高于对照组(0.81%,P<0.001);ADO作用HepG2细胞后荧光显微镜观察到细胞凋亡的形态学改变,FCM分析药物处理组显示典型特征性的亚二倍体凋亡峰(sub-G1),细胞生长周期阻滞于G0/G1期;同时伴有Caspase-3活性显著升高(P<0.05).ADO处理后显著增加了NF-κB蛋白表达(P<0.05);PDTC有效抑制了NF-κB表达,同时增加了 Caspase-3活性及ADO的细胞毒作用(P<0.05).结论 ADO诱导了HepG2细胞凋亡并活化Caspase-3.抑制NF-κB活性可通过Caspase-3途径增强ADO的细胞毒作用.     

二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响

目的 探讨二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响.方法培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml的密度接种于96孔培养板(100 μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=12),正常对照组(C组)不作任何处理,缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)和二氮嗪预先给药+5-羟葵酸组(DZ+5-HD组)均进行缺氧2 h复氧2 h,DZ组和DZ+5-HD组在缺氧前2 h分别加入100 μmol/L二氮嗪和100 μmol/L二氮嗪+100 μmol/L线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸.于复氧2 h时测定细胞活力和凋亡率.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高(P＜0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P＜0.05或0.01);5-羟葵酸可抑制二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05或0.01).结论 二氮嗪预先给药可抑制大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡,从而减轻缺氧复氧损伤,其机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关.

Abstract：

Objective To investigate the effects of diazoxide pretreatment on apoptosis in rat myocardial microvascular endothelial cells exposed to hypoxia-reoxygenation (H/R) . Methods The SD rat myocardial microvascular endothelial cells were cultured. The cells were seeded in 96-well plates (100 μl/hole) or in 6 cm diameter dishes (2 ml/dish) with the density of 1×106/ml and randomly divided into 4 groups ( n = 12 each) : normal con trol group (group C), H/R group, diazoxide pretreatment group (group DZ) and diazoxide pretreatment + 5-hydroxydecanoate (5-HD, a mitochondrial ATP-sensitive potassium channel blocker) group (group DZ + 5-HD) .The cells were exposed to 2 h hypoxia followed by 2 h reoxygenation. Diazoxide 100 μmol/L and diazoxide 100 μmol/L + 5-HD 100 μmol/L were added to the culture medium 2 h before hypoxia in groups DZ and DZ + 5-HD respectively. The cell viability and apoptotic rate were detected at the end of reoxygenation. Results Compared with group C, the cell viability was significantly decreased, while the apoptotic rate increased in group H/R ( P ＜ 0.01) . Compared with group H/R, the cell viability was significantly increased, while the apoptotic rate decreased in group DZ (P ＜ 0.05 or 0.01) . 5-HD could inhibit diazoxide pretreatment-induced changes mentioned above ( P ＜ 0.05 or 0.01). Conclusion Diazoxide pretreatment can reduce H/R injury through inhibiting apoptosis in rat myocardial microvascular endothelial cells, and the mechanism is related to the activation of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels.     

Klotho alleviates toxic effect of indoxyl sulfate on vascular endothelial cells and its mechanism

Objective To investigate the effect of klotho on the human vein umbilical endothelial cells (HUVECs) injury induced by indoxyl sulfate (IS) and to explore its mechanism and the role of endoplasmic reticulum stress (ERS) in this process. Methods (1) The cell vitalities of HUVECs incubated with different concentration of IS (5, 25, 50 mg/L) for 48 h and with 50 mg/L IS for different time points (12, 24, 48 h) were measured by CCK-8 assay. (2) HUVECs were incubated with 50 mg/L IS and different concentration of klotho (0, 1, 10, 100 μg/L) for 48 h and their cell viabilities were measured by CCK-8 assay. (3) HUVECs were divided into four groups: control group, IS group (50 mg/L IS), klotho group (50 mg/L IS+100 μg/L klotho) and Compound C group (50 mg/L IS+100 μg/L klotho+10 μmol/L Compound C). The cell vitality and the apoptosis of HUVECs were evaluated by CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. The mRNA and protein expressions of GRP78 and CHOP were measured by real-time PCR and Western blotting. The phosphorylation level of AMPK was tested by Western blotting. Results IS inhibited cell vitality in the time-dependent and concentration-dependent manner. The cell viability of HUVECs with 50 mg/L IS was lower than normal control (P＜0.05). The inhibited cell vitality induced by IS was partly restored by klotho in concentration-dependent manner. The cell viability was higher in 100 μg/L klotho+50 mg/L IS group than 50 mg/L IS group (P＜0.05). Compared with control group, the expressions of GRP78 and CHOP and cell apoptosis increased, however, the level of phosphorylated AMPK (p-AMPK) decreased in IS group (all P＜0.05). Compared with IS group, the expressions of GRP78 and CHOP and cell apoptosis decreased and the level of p-AMPK increased in klotho group (all P＜0.05). Furthermore, the above effects of klotho could be partly blocked by Compound C. The above indexes showed statistical differences between Compound C group and klotho group. Conclusions IS can inhibit the HUVECs cell vitality, and induce ERS and cell apoptosis. Klotho protein could antagonize the above effects, probably through activating AMPK pathway and reducing ERS-mediated cell apoptosis.