变形链球菌葡聚糖结合蛋白的研究进展

本文介绍了一类对牙菌斑的发育,结构和致龋力具有重要意义的变形链球菌表面蛋白－葡聚糖结合蛋白,阐述了其作用,种类及分子结构等。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B的纯化

目的：从变形链球菌S.mutans Ingbritt(serotype c)培养液上清中纯化葡聚糖结合蛋白B。方法：Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－SephroseFF离子交换层析。结果：纯化出约10μg具有葡聚糖结合特性的GbpB蛋白。结论：通过Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－Sephrose FF离子交换层析纯化出变链菌葡聚糖结合蛋白B。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白D(gbpD)基因失活菌株体外黏附能力的实验研究

目的:体外观察gbpD基因失活菌株在羟基磷灰石表面的黏附能力,为明确GbpD在变形链球菌黏附过程中的作用提供实验依据。方法:荧光标记gbpD失活菌和野生菌,与唾液包被的羟基磷灰石粉末共同孵育后,测定羟基磷灰石沉淀的荧光值,比较粘附率的差异。结果:发现gbpD失活菌的黏附率(19.7%±0.91)低于野生菌(29.5%±2.9),差异有显著性(P<0.05);当加入抗GbpD抗体后,变形链球菌UA159的黏附率低于未加抗体组(P<0.05)。结论:GbpD的缺失严重影响了变形链球菌与唾液包被羟基磷灰石的粘附,抗GbpD抗体对这种粘附有一定的抑制作用,表明GbpD与变形链球菌的粘附能力有关。     

葡聚糖结合蛋白A抗体对变形链球菌黏附影响的研究

目的：了解葡聚糖结合蛋白(CbP)A抗体对变形链球菌黏附的影响情况。方法：利用核素闪烁计数法，测定不同浓度的葡聚糖结合蛋白抗体影响两种变形链球菌对羧基磷灰石(HA)的黏附率。结果：葡聚糖结合蛋白抗体可明显抑制两种变形链球菌对羧基磷灰石的黏附率，并且随着葡聚糖结合蛋白抗体浓度的提高，抑制作用增强。结论：葡聚糖结合蛋白抗体可抑制变形链球菌对羧基磷灰石的黏附，在免疫防龋方面具有一定的意义。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白研究进展

葡聚糖结合蛋白是变形链球菌致龋的重要毒力因子。与变形链球菌的粘附、聚集、细胞壁生理功能、酶活性和形成生物膜并维持其结构稳定起重要作用。该文就变形链球菌4种葡聚糖结合蛋白研究现状,葡聚糖结合蛋白与生物膜、防龋疫苗的关系及当前存在的问题作一综述。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的分子克隆

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白Ｃ基因（ｇｂｐＣ）编码序列的特异片段。方法：根据文献报道的ｇｂｐＣ序列设计并合成一对寡核苷酸引物,ＰＣＲ扩增位于ｇｂｐＣ编码序列１１０５～１５５４ｂｐ间的一段牧民片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体ｐｕｃ１８中,连接产物转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。结果：测序结果与Ｓａｔｏ等报道的序列一致。结论：成功克隆了ｇｂｐＣ基因片段     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白D基因的分子克隆及其原核表达和初步纯化

目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白D(gbpD)基因,在大肠杆菌中表达并对重组蛋白进行初步纯化,为进一步的蛋白功能研究奠定基础。方法:体外培养变形链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因编码区进行PCR扩增,连接pMD-18T载体并测序。随后将该片段克隆入原核表达载体pPROEX HTb中,构建表达质粒pPROEX/gbpD,转化大肠杆菌DH5α并用IPTG诱导表达。表达产物经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果:成功克隆变形链球菌gbpD基因并在大肠杆菌中得到可溶性表达,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度大于95%、相对分子量(Mr)为76×103的变链菌GbpD蛋白。结论:获得Mr为76×103的变形链球菌GbpD蛋白。对进一步确定GbpD的葡聚糖结合能力,探讨其在变链菌致龋过程中的作用,以及在龋病预防领域的应用前景都具有重要的意义。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :在大肠杆菌中表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因 (glucanbindingproteinB ,gbpB) ,并对重组蛋白进行初步纯化 ,为下一步制备多抗和进行相关的研究奠定基础。方法 :将克隆到的gbpB全长编码区基因克隆到表达载体 pPROEXTMHTb ,构建表达质粒 pPROEXTMHTb - gbpB ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌经IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白条带 ,相对分子量 (Mr)为 4 .5～ 5 .0× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度较高的重组葡聚糖结合蛋白B。结论 :获得Mr为 4 .5～ 5 .0× 10 3 的重组葡聚糖结合蛋白B     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因防龋疫苗的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(gbpB)真核表达质粒pcDNA3．1( )-gbpB在哺乳动物细胞COS-7的表达情况，方法：通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3．1( )-gbpB，通过脂质体转染法将其转染车COS-7细胞，通过免疫组化SABC法检洲其在COS-7细胞的表达结果：pcDNA3．1( )-gjhB质粒转染的细胞胞浆中呈棕黄色染色，胞核中无着色，pcDAN3．1( )空载体转染的细咆咆浆及胞核无着色，空白对照组也无着色结论：质粒pcDNA3．1( )-ghpB转染COS-7后能够住细胞内翻译、表达，表达的蛋白质位于胞浆中．可与抗GbpB抗体特异性结合，具存抗原性，可作为基因疫苗。     

变形链球菌UA159上葡聚糖结合蛋白C的定位探讨

目的探索C端结构变异为亮氨酸-脯氨酸-任意氨基酸-丙氨酸-甘氨酸（LPXAG）的葡聚糖结合蛋白C（glucan binding proteinC，GbpC）是否在变形链球菌UA159的细胞壁上。方法用PCR法扩增变形链球菌UA159GbpCC端的编码基因片段，推测和分析C端氨基酸序列组成；分别提取上清蛋白、胞内蛋白和胞壁蛋白，用Western blot法在变形链球菌UA159各成分中检测GbpC；用免疫金标直接观察GbpC的表达位置；应激条件下进行多聚糖依赖黏附实验。结果变形链球菌UA159GbpCC端亮氨酸-脯氨酸-任意氨基酸-苏氨酸-甘氨酸（LPXTG）的结构变异为LPXAG；免疫印迹叮以在细菌的壁蛋白中检测到GbpC；电镜下可以观察到金颗粒围绕细菌细胞壁聚集；变形链球菌UA159在应激条件下表现为多糖依赖黏附实验阳性。结论C端为LPXAG的GbpC仍然锚定在细菌的细胞壁上。     

变异链球菌葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展

变异链球菌是人类龋病的主要致病菌,葡聚糖结合蛋白是其重要的毒力因子之一.葡聚糖结合蛋白B在变异链球菌的致龋、维持细菌形态、发挥细胞壁生理功能等方面有重要作用,同时其N端具有免疫原性,可应用于免疫防龋.下面就葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展作一综述.     

变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD肽段的纯化及葡聚糖结合功能实验

目的：纯化变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD肽段。方法：蛋白质技术：金属螯合亲和层析，葡萄糖结合实验。结果：通过蛋白质技术及金属螯合亲和层析，纯化出可融性融合蛋白GBD。此蛋白可与α－1，6键葡聚糖结合。结论：通过基因重组技术成功纯化出变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD肽段并证实此重组蛋白具有葡聚糖结合功能。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因（Glucan-binding protein C gene,gbpC）编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达。方法：根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342bp～1794bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。将克隆获得的约0．45kb的gbpC基因特异片段经EcoRI／SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1／gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达融合蛋白GST-GbpC^E,SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合。结论：成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpC^E,为制备GbpC抗体打下了基础。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B功能区片段的分子克隆及表达

目的 :克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :通过PCR技术克隆GbpB功能区的基因片段并通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌中表达。 结果 :成功克隆了GbpB功能区的基因片段 ,并在大肠杆菌中得到其融合蛋白的表达。 结论 :利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得其融合蛋白的表达 ,为后续研究奠定了基础     

携带变形链球菌表面蛋白、葡聚糖结合蛋白及信号肽基因的真核表达质粒的构建

目的通过构建带有变形链球菌表面蛋白SpaP的P区、葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区（glucan bind-ing domain,GBD）及一段信号肽基因的嵌和体真核表达质粒pSSG,为基因疫苗的制备提供实验基础。方法通过PCR扩增,获得分别编码SpaP的P区和GBD的两个基因片段sp和gg,以及人白介素2信号肽基因（signal）。将它们分别定向插入pMD20-T克隆载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,初步鉴定后测序。将获得的3个基因片段分别双酶切,胶回收纯化后将同样进行双酶切的pVAX1质粒在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应,获得真核表达质粒pSSG,并转化DH5α,提取纯化pSSG,进行质粒RCR,酶切电泳鉴定并测序。结果真核表达质粒pSSG构建正确,目的基因sp、gg和signal定向插入至真核表达载体。结论真核表达质粒pSSG包含了SpaP的P区和GBD以及人白介素2信号肽的编码基因,为基因疫苗研究奠定基础。     

变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并使其在大肠杆菌中获得表达。方法：PCR技术克隆GBD片段及蛋白重组融合表达技术获得其在大肠杆菌中的表达。结果：成功克隆变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并在大肠杆菌中得到表达。结论：利用分子生物学技术能够成功克隆目的基因并获得融合蛋白的表达。     

变形链球菌粘附调节基因研究进展

变形链球菌是主要致龋菌之一。粘附是变链菌形成生物膜的初期阶段,也是必经阶段,是公认的细菌四大致龋条件(细菌的粘附、生物膜形成能力、菌细胞代谢碳水化合物能力及细菌对不断波动环境的适应能力)之一。分析与粘附相关的变链菌基因,将有助于我们从分子水平上探索变链菌在生物膜环境中的致龋机理,为从基因水平探索和丰富龋病病因学及龋病防治提供理论依据。