抗PML-RARα反义核酸对NB4细胞形态、PML-RARαmRNA及蛋白质表达的影响

目的探讨抗ＰＭＬＲＡＲα反义核酸（ＦＵＡＳ）对ＮＢ４细胞的分化、ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达及ＰＭＬ／ＰＭＬＲＡＲα蛋白细胞内定位的影响。方法以ＮＢ４细胞为研究对象,细胞形态观察采用Ｗｒｉｇｈｔ染色法;ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达采用ＲＴＰＣＲ法;ＰＭＬ／ＰＭＬＲＡＲα蛋白细胞内定位采用免疫荧光技术。结果ＦＵＡＳ处理后第５天,细胞出现部分分化。处理后２４,７２,１２０小时,ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达分别下降５２．０％、６８．７％、２３．４％。抗ＰＭＬ抗体免疫荧光检测,ＦＵＡＳ处理２４小时后,细胞内微小颗粒消失,残存颗粒变大,１２０小时细胞内颗粒几乎消失。结论ＦＵＡＳ特异性阻断ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达,使ＰＭＬＲＡＲα融合蛋白合成减少甚至消失,进而促进细胞分化     

抗PML-RARα反义核酸的设计、合成和对NB4细胞生长、凋亡的影响

目的合成针对长型ＰＭＬＲＡＲα融合基因ｍＲＮＡ起始部位和融合位点的反义核酸（ＡＳ），探讨ＡＳ的稳定性、特异性及其对ＮＢ４细胞生长、凋亡的影响。方法以ＮＢ４细胞株为研究对象，采用台盼蓝拒染法进行细胞计数；聚丙烯酰胺凝胶进行寡核苷酸的电泳；流式细胞仪、ＤＮＡ电泳、细胞荧光染色进行细胞凋亡检测。结果合成的ＡＳ稳定、耐细胞内外核酸酶、无非特异性作用；起始部位ＡＳ（ＳＴＡＳ）和融合位点ＡＳ（ＦＵＡＳ）明显抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性。浓度２０μｇ／ｍｌ时增殖抑制率０％～１１．３％；８０μｇ／ｍｌ时，抑制率５０．０％～６７．７％。ＦＵＡＳ（６０μｇ／ｍｌ）处理第７天、第９天出现明显的凋亡细胞群，处理后３天、５天、７天、９天的凋亡细胞率分别为９．３％、２４．５％、４１．０％、３４．２％。结论针对长型ＰＭＬＲＡＲα融合基因的ＡＳ设计、合成是成功的；抗ＰＭＬＲＡＲαＡＳ能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。     

氧化砷诱导维甲酸耐药早幼粒细胞白血病细胞(MR-2)凋亡的体外研究

目的：深入了解氧化砷（Ａｓ２Ｏ３）治疗急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）的机制。方法：以对全反式维甲酸耐药的ＡＰＬ细胞株ＭＲ２为模型，用细胞生长、活力测定、形态学观察和流式细胞仪分析、四氮唑蓝还原反应及免疫荧光等指标观察Ａｓ２Ｏ３治疗ＡＰＬ的效应途径。结果：１．０μｍｏｌ／ＬＡｓ２Ｏ３可诱导ＭＲ２细胞凋亡，并能降解ＡＰＬ特异蛋白ＰＭＬＲＡＲα融合蛋白。结论：Ａｓ２Ｏ３治疗ＡＰＬ的效应途径可能不同于ＡＴＲＡ，但ＰＭＬＲＡＲα可能是二者的共同作用靶点     

抗PML—RARα反义核酸对NB4细胞形态,PML—RARα mRNA及蛋白质？…

目的 探讨抗ＰＭＬ－ＲＡＲα反义核酸（ＦＵＡＳ）对ＮＢ４细胞的分化、ＰＭＬ－ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达及ＰＭＬ／ＰＭＬ－ＲＡＲα蛋白细胞内定位的影响。方法 以ＮＢ４细胞为研究对象,细胞形态观察采用Ｗｒｉｇｈｔ染以法;ＰＭＬ－ＲＡＲαｍＲＮＡ表达采用ＲＴ－ＰＣＲ法;ＰＭＬ／ＰＭＬ－ＲＡＲα蛋白细胞内定位采用免疫荧光技术。结果 ＦＵＡＳ处理后第５天,细胞出现部分分化。处理后２４,７２,１２０小时,ＰＭＬ－     

急性早幼粒细胞白血病基因分析

目的：分析急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）患者经全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）联合细胞毒药物及异基因骨髓移植（ａｌｏ－ＢＭＴ）治疗后融合基因的变化。方法：采用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对２２例ＡＰＬ患者治疗前后ＲＡＲα／ＰＭＬ融合基因进行检测。其中１２例患者为单纯化疗，１０例接受了ａｌｏ－ＢＭＴ，９例患者于第１次完全缓解（ＣＲ１）期、１例于第１次复发（ＲＲ１）期接受了ａｌｏ－ＢＭＴ。结果：单纯维甲酸诱导完全缓解时，７５％ＡＰＬ患者融合基因仍然阳性；继用强化疗后８３％患者融合基因转为阴性，ＲＴ－ＰＣＲ转阴时间为发病后１～３９个月；ａｌｏ－ＢＭＴ后４个月内及４个月后，分别有６２．５％及８５．７％患者融合基因转阴。结论：化疗及ＢＭＴ均可使患者融合基因转阴，ａｌｏ－ＢＭＴ似乎能更快地清除体内白血病细胞     

氧化砷对白血病细胞内 PML/PML-RARα 蛋白的影响

目的：探讨急性早幼粒细胞白血病细胞的分子标志ＰＭＬ－ＲＡＲα在氧化砷（Ａｓ２Ｏ３）诱导的细胞凋亡中的可能作用。方法：观察Ａｓ２Ｏ３对ＰＭＬ－ＲＡＲα蛋白在亚细胞定位的影响。结果：①在１μｍｏｌ／Ｌ的Ａｓ２Ｏ３作用下，ＨＬ－６０细胞核内ＰＭＬ抗血清染色明显减少，而在胞浆的近核膜区出现弥散分布的荧光染色；②Ａｓ２Ｏ３诱导ＮＢ４细胞内散在分布的ＰＭＬ抗血清染色颗粒明显减少；③通常情况下，少数ＮＢ４细胞的胞浆中存在ＰＭＬ抗血清染色颗粒的聚集，这类细胞在Ａｓ２Ｏ３作用后明显增多，凋亡细胞中ＰＭＬ抗血清染色聚集现象也存在；④全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）预处理２４或４８小时并不改变Ａｓ２Ｏ３对ＮＢ４细胞的凋亡诱导效应。结论：Ａｓ２Ｏ３诱导细胞凋亡的过程不依赖维甲酸信号途径，可能通过ＰＭＬ／ＰＭＬ－ＲＡＲα及其它相关基因或蛋白的调控来实现。     

急性早幼粒细胞白血病发病及诱导分化机制研究进展

急性早幼粒细胞白血病（ａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ,ＡＰＬ）是临床上第一个应用诱导分化治疗取得成功和第一种针对肿瘤特异性标志分子进行治疗的人类恶性肿瘤。９５％以上ＡＰＬ患者具有特征性的非随机染色体ｔ（１５;１７）。该易位使１５号染色体上的早幼粒细胞白血病（ＰＭＬ）基因与１７号染色体上的维甲酸受体α（ＲＡＲα）基因发生融合,表达ＰＭＬＲＡＲα融合蛋白［１］。少数变异型ＡＰＬ患者产生ｔ（１１;１７）,该易位使１１号染色体上的早幼粒细胞白血病锌指（ＰＬＺＦ）基因与１７号染色体…     

急性早幼粒细胞白血病全反式维甲酸治疗时IL-8及其受体表达的观察

目的：探讨白细胞介素８（ＩＬ８）及其Ａ型受体（ＩＬ８ＲＡ）的表达在全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）诱导治疗急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）中的临床意义。方法：动态检测ＡＰＬ患者１８例ＡＴＲＡ治疗中血浆ＩＬ８水平（ＥＬＩＳＡ法），取３例骨髓单个核细胞（ＭＮＣ）加ＡＴＲＡ（１０－６ｍｍｏｌ／Ｌ）体外诱导，流式细胞仪动态检测ＭＮＣ膜ＩＬ８ＲＡ的表达。结果：ＭＮＣ加ＡＴＲＡ诱导７２小时，上清ＩＬ８水平明显下降，ＭＮＣ膜表达ＩＬ８ＲＡ增高；维甲酸综合征（ＲＡＳ）发生前血浆ＩＬ８异常升高（达１０１０～２０００ｎｇ／Ｌ），较体温及白细胞数量变化更敏感；感染时血浆ＩＬ６、ＩＬ８水平均明显升高［分别为（１１２．３４±５７．３１）×１０３Ｕ／Ｌ，２３４．１６±７２１８ｎｇ／Ｌ］；弥散性血管内凝血（ＤＩＣ）恶化时ＩＬ８与Ｄ二聚体异常同步上升。结论：ＡＴＲＡ抑制ＡＰＬ细胞分泌ＩＬ８，加强ＩＬ８ＲＡ的表达；监测ＩＬ８水平可预测ＲＡＳ及感染发生；ＩＬ８与Ｄ二聚体异常同步上升提示ＤＩＣ恶化趋势。     

儿童B系急性淋巴细胞白血病TEL-AML1融合基因的研究

目的了解ＴＥＬＡＭＬ１融合基因在儿童Ｂ系急性淋巴细胞白血病（急淋）中的发生率及其与临床诊断和预后的关系,并比较巢式逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）和双标记荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）两种方法。方法采用巢式ＲＴＰＣＲ和双标记ＦＩＳＨ技术检测ＴＥＬＡＭＬ１融合基因。结果和结论ＲＴＰＣＲ检测发现儿童Ｂ系急淋中２２．５％（４０例中９例）的患者有ＴＥＬＡＭＬ１融合基因转录本,这类患者预后较好,完全缓解率达１００％。ＲＴＰＣＲ和ＦＩＳＨ技术是检测ＴＥＬＡＭＬ１的有效方法,并为临床诊断和预后估计提供了有一定价值的手段。     

维甲酸和三氧化二砷下调NB4细胞组织因子表达的作用机制

目的 研究全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）和三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）下调ＮＢ４细胞组织因子（ＴＦ）表达的作用机制。方法 用放线菌酮抑制蛋白合成和用放线菌素Ｄ阻断ＲＮＡ合成后,用逆转录－降合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＴＲＡ对ＮＢ４细胞ＴＦｍＲＮＡ转录的影响。将含有ＰＭＬ－ＲＡＲα融合蛋白全部编码序列的重组逆转录病毒质粒转染Ｕ９３７细胞,以转染空载体的Ｕ９３７细胞为对照,用ＥＬＩＳＡ方法检测ＡＴＲＡ和Ａｓ     

三氧化二砷联合8-CPT-cAMP诱导维甲酸耐药早幼粒细胞白血病细胞分化的实验研究

目的 了解三氧化二砷（As2O3)联合8-对氯苯硫基环腺苷酸（8-CPT-cAMP)对维甲酸（RA）耐药、的急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞的作用。方法 以RA耐药的APL细胞株NB4-R1和NB4-R2为模型。通过观察细胞生长，形态，表面分化抗原以及对四氮唑蓝的还原能力的改变来研究As2O3,8-CPT-cAMP单独和联合对细胞增殖及分化的影响；并应用免疫荧光和Western blot检测药物处理前后细胞内PML-RARα融合蛋白以及细胞周期调控蛋白的变化。结果 低剂量As2O3(0.25μmol/L）与8-CPT-cAMP(200μmol/L）可协同促进NB4-R1和NB4-R2细胞分化。8-CPT-cAMP可通过影响细胞周期调控蛋白E2F和P21的表达而抑制细胞增殖，并促进As2O3介导的PML-RARα融合蛋白降解。结论 As2O3联合8-CPT-cAMP能够诱导RA耐药的APL细胞分化。     

免疫荧光动态监测急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合蛋白变化

背景：实时定量RT-PCR只能间接地反映融合基因表达量的变化,并不能在细胞原位直观反映急性早幼粒细胞白血病患者细胞内PML-RARα融合蛋白在全反式维甲酸治疗前后的相对表达量。目的：探讨免疫荧光技术检测融合蛋白PML-RARα表达的动态变化在判断急性早幼粒细胞白血病的全反式维甲酸早期治疗的效果。方法：应用免疫荧光技术检测全反式维甲酸干预的急性早幼粒细胞白血病经典细胞株NB4细胞或来源于急性早幼粒细胞白血病患者的NB4细胞PML-RARα蛋白的表达,以实时定量RT-PCR检测细胞PML-RARα mRNA的表达作为对照,以评价免疫荧光技术的可靠性。结果与结论：免疫荧光染色显示,无论是体外培养的NB4细胞,还是患者骨髓内的NB4细胞,在全反式维甲酸干预前细胞内均可见大量红色的融合蛋白PML-RARα,大小不均一、形状不规则,全反式维甲酸干预后,NB4细胞内红色的融合蛋白PML-RARα形状逐渐规则,弥散状态变为散在分布,且随着全反式维甲酸干预时间的延长,原有的弥散状态逐渐消失。实时定量RT-PCR测得的PML-RARα mRNA的变化趋势与免疫荧光相一致。说明免疫荧光技术检测PML-RARα能够更为直观地判断全反式维甲酸的治疗效果。     

Therapeutic targeting of nuclear receptor corepressor misfolding in acute promyelocytic leukemia cells with genistein

We have recently reported that PML-RAR-induced misfolding of the N-CoR protein could be reversed by retinoic acid (RA), a therapeutic agent that promotes differentiation of acute promyelocytic leukemia (APL) cells. This finding suggests a role of misfolded N-CoR in the differentiation arrest of APL cells and highlights its significance as a potential molecular target in protein conformation-based therapy for APL. Based on this hypothesis, we investigated the therapeutic potential of several protein conformation modifiers on APL-derived cell lines NB4 and NB4-R1. Through a small-scale screening of these selected compounds, we identified genistein as a potent inhibitor of growth of both RA-sensitive and RA-resistant APL cells. Genistein inhibited the growth of NB4 cells through its collective regulatory effects on cell cycle progression, differentiation, and apoptosis. Genistein-induced apoptosis of NB4 cells was mediated by activation of caspase-9 and caspase-3 and was associated with a decrease in mitochondrial transmembrane potential and cytosolic release of cytochrome c. Genistein promoted differentiation of both RA-sensitive and RA-resistant NB4 cells and induced cell cycle arrest by blocking the G(2)-M transition. Genistein up-regulated the expression of PML and N-CoR proteins, promoted degradation of PML-RAR, and reorganized the microspeckled distribution of PML oncogenic domains to a normal dot-like pattern in NB4 cells. Moreover, genistein significantly reversed the PML-RAR-induced misfolding of N-CoR protein by possibly inhibiting the selective phosphorylation-dependent binding of N-CoR to PML-RAR. These findings identify genistein as a potent modifier of N-CoR protein conformation and highlights its therapeutic potential in both RA-sensitive and RA-resistant APL cells.     

Targeting expression of the leukemogenic PML-RARα fusion protein by lentiviral vector-mediated small interfering RNA results in leukemic cell differentiation and apoptosis

Acute promyelocytic leukemia (APL) results from a chromosomal translocation that gives rise to the leukemogenic fusion protein PML-RARα (promyelocytic leukemia-retinoic acid α receptor). Differentiation of leukemic cells and complete remission of APL are achieved by treatment of patients with pharmacological doses of all-trans retinoic acid (ATRA), making APL a model disease for differentiation therapy. However, because patients are resistant to further treatment with ATRA on relapse, it is necessary to develop alternative treatment strategies to specifically target APL. We therefore sought to develop a treatment strategy based on lentiviral vector-mediated delivery of small interfering RNA (siRNA) that specifically targets the breakpoint region of PML-RARα. Unlike treatment with ATRA, which resulted in differentiation of leukemic NB4 cells, delivery of siRNA targeting PML-RARα into NB4 cells resulted in both differentiation and apoptosis, consistent with the specific knockdown of PML-RARα. Intraperitoneal injection of NB4 cells transduced with lentiviral vectors delivering PML-RARα-specific siRNA but not control siRNA prevented development of disease in nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice. Taken together, these results indicate that development of PML-RARα-specific siRNA may represent a promising treatment strategy for ATRA-resistant APL.     

姜黄素联合全反式维甲酸诱导耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的实验研究

本研究旨在探讨姜黄素联合全反式维甲酸(ATRA)对耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的影响及其分子机制。以耐药的NB4-R1细胞为实验对象,对细胞进行计数和细胞形态学观察,应用流式细胞术(FCM)检测姜黄素单用或联合ATRA对NB4-R1细胞增殖、分化的影响;用Western blot检测AKT磷酸化在细胞分化中的变化。结果显示,全反式维甲酸对NB4-R1细胞增殖无影响,但可增强姜黄素对NB4-R1生长的抑制作用。单用姜黄素或全反式维甲酸对细胞分化无影响,姜黄素联合全反式维甲酸可明显诱导细胞CD11b表达,细胞在形态上呈明显分化特征。全反式维甲酸可在短时间内促进NB4细胞AKT第473苏氨酸磷酸化,而对NB4-R1细胞中的AKT磷酸化影响不大。姜黄素可以促进NB4-R1细胞AKT磷酸化,而联合全反式维甲酸可进一步增强AKT磷酸化。结论:PI3K/AKT通路失活可能是导致APL细胞耐药的因素之一,而姜黄素通过活化PI3K/AKT信号通路逆转APL耐药,促进NB4-R1细胞分化。     

PML-RARα对BHLHB2基因转录调控的影响

本研究探讨异常转录因子PML-RARα对BHLHB2基因的转录调控机制,进一步揭示急性早幼粒细胞性白血病(APL)的致病机理。利用RT-PCR技术研究PML-RARα融合蛋白及ATRA在APL模式细胞株PR9和APL病人来源的NB4细胞中对BHLHB2转录的影响;利用ChIP-PCR技术探讨PML-RARα在体内调控BHLHB2转录的作用方式;通过分析病人样本数据,观察BHLHB2在各种急性髓系白血病(AML)中的表达情况。结果表明,随着PML-RARα融合蛋白的表达升高,BHLHB2的转录受到明显抑制,并且无论在APL模式细胞株PR9还是APL病人来源的NB4细胞中,ATRA均能够解除这种抑制,诱导BHLHB2的表达上调;而在不表达PML-RARα的U937细胞株中,ATRA不能诱导BHLHB2的表达上调。研究结果提示,PML-RARα通过结合于BHLHB2的启动子区域抑制其转录。与其他类型的AML和正常的骨髓细胞相比,BHLHB2在APL中表达较低。结论:BHLHB2是PML-RARα的靶基因,PML-RARα通过与其启动子区域结合对其转录进行负调控。     

新维甲类化合物对早幼粒细胞白血病和正常造血增殖分化作用的…

发掘维甲１号、维甲２号、维甲３号和维甲４号应用价值。在体外研究其对人急性早幼粒细胞白血病细胞株ＮＢ４和原代ＡＰＬ细胞诱导分化和克隆增殖的抑制及其对正常造血细胞的促增殖作用。研制的新维甲类化合物对ＡＰＬ细胞具有诱导分化并对其克隆生长有抑制作用，且能促进正常造血，其中以维甲２号分化作用为突出进一步研究开发它的临床应用有一定的价值。     

新维甲类化合物对早幼粒细胞白血病和正常造血增殖分化作用的体外研究

目的：发掘维甲１号、维甲２号、维甲３号和维甲４号（与全反式维甲酸结构不同的新维甲类化合物）应用价值。方法：在体外研究其对人急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）细胞株ＮＢ４和原代ＡＰＬ细胞诱导分化和克隆增殖的抑制及其对正常造血细胞的促增殖作用。结果：细胞形态学、ＮＢＴ反应、细胞周期动力学和ＣＦＵ－Ｌ克隆形成抑制率等多参数研究表明，新维甲类化合物具有诱导ＮＢ４细胞株和原代ＡＰＬ细胞分化成熟及抑制ＣＦＵ－Ｌ克隆生长的作用，作用强度与结构有关，维甲２号活性较强，明显高于全反式维甲酸及其它新维甲类化合物（Ｐ＜０．０１）。半固体造血祖细胞集落培养研究表明，新维甲类化合物能促进ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｍｅｇ增殖。结论：研制的新维甲类化合物对ＡＰＬ细胞具有诱导分化并对其克隆生长有抑制作用，且能促进正常造血，其中以维甲２号分化作用为突出，进一步研究开发它的临床应用有一定的价值。     

Survivin基因在NB4细胞株细胞和急性早幼粒细胞白血病细胞表达及其抗凋亡作用与临床意义

为了检测survivin基因在APL细胞中的表达率并探讨其表达与临床的相关性，本研究采用RT-PCR方法检测PML／RARα和survivin mRNA表达。结果显示：NB4细胞经过ATRA处理后，survivin mRNA表达随着时间的延长而逐渐下降，在72小时几乎检测不到survivin mRNA表达。36例初发、复发APL患者骨髓单个核细胞均有PML／RARα融合基因表达，其中survivin mRNA阳性表达24例（占67％），阴性表达12例（占33％）；22例缓解期APL患者骨髓单个核细胞PML／RARα融合基因表达均为阴性，其中survivin mRNA阳性表达8例（占36％），阴性表达14例（占64％）；初发、复发组、PML／RARa基因长型阳性组与缓解组相比，survivin mRNA表达阳性率均明显增高（两者P值均〈0．05），而与急性白血病组相比survivin mRNA表达阳性率均明显减低（两者P值分别〈0．05，〈0．001）。36例初发、复发APL患者，无论survivin mRNA表达阳性或阴性，用ATRA治疗都能达到完全缓解；临床上并发DIC和严重感染的4例APL患者的survivin mRNA表达皆为阳性（其中1例死亡），而survivin mRNA表达阴性患者临床症状均较轻，只有轻微的皮肤粘膜出血、发热和乏力等症状。2例APL患者经用ATRA治疗后外周血象以及骨髓象诱导分化症象不明显者，其survivin mRNA表达均为阳性。结论：APL患者骨髓单个核细胞survivin基因阳性表达率较其它类型急性白血病明显减低，survivin基因表达与临床有一定的相关性。