云南省傣,彝,汉族人凝血因子ⅧST14（DXS52）VNTR的研究

甲型血友病是凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）基因缺陷导致的一种遗传性出血性疾病。近年来已发现大量甲型血友病的基因缺陷。我们应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，分析了云南省傣、彝、汉族人ＳＴ１４（ＤＸＳ５２）可变数目串联重复序列（ＶＮＴＲ）的多态性特点，现报道如下。对象...     

广东汉族人群St14（DXS52）VNTR与血友病A携带者的检测

目的 研究广东正常人群Ｓｔ１４（ＤＸＳ５２）位点的遗传多态性,为血友病Ａ的基因诊断提供依据。方法 采用扩增片段长度多态性（Ａｍｐ－ＦＬＰ）分析技术,检测了广东地区无血缘关系的正常汉族个体１２５名,男２１名,女１０４名,总计２２９条Ｘ染色体。利用此数目可变串联重复序列（ＶＮＴＲ）多态作为遗传标记,对４个血友病Ａ家系进行连锁分析。结果 共栓出１１种等位片段,其片段大小为７００￣１８１０ｂｐ,基因频率分     

云南省三民族人FⅧ基因XbaⅠ限制性片段长度多态性研究

血友病甲是由于凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）基因缺陷所致的Ｘ染色体连锁隐性遗传性疾病［１］，ＦⅧ基因定位于Ｘ染色体长臂末端２区８带（Ｘｑ２８）全长约１８６ｋｂ，包括２６个外显子和２５个内含子。目前多利用ＤＮＡ限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰｓ）［２］和可变数...     

逆转录病毒载体介导入凝因子因子Ⅷ的体外高效表达

目的建立逆转录病毒载体介导的人凝血子因子Ⅷ（ＦⅧ）体外高效表达体系。方法将－Ｂ区缺失（７６０ａａ－１６３９ａａ）的人ＦⅧｃＤＮＡ（ＦⅧＢＤｃＤＮＡ）克隆至逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建了重组表达载体ｐＬＮＣ－ＦⅧＢＤ。经ＰＡ３１７细胞包装后,感染多种靶细胞。分别采用一期法、ＥＬＩＳＡ法和ＲＴ－ＰＣＲ检测细胞培养上清中人ＦⅧ的凝血活性（ＦⅧ：Ｃ）和抗原含量（ＦⅧ：Ａｇ）以及细胞中ＦⅧＢＤ ｃＤＮＡ的     

人FⅧ基因高效表达质粒的构建及其在Cos-7细胞中的表达

目的：构建人ＦⅧ真核表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋＦⅧＤＢ并观察其在Ｃｏｓ－７细胞中的表达活性。方法：采用缺失大部分Ｂ结构域的人凝血因子ⅧｃＤＮＡ（ＦⅧＤＢ），长度为４．６ｋｂ，将其插入含腺病毒序列表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋ１，构建了ＦⅧ真核表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋＦⅧＤＢ，用脂质体介导法将其转染Ｃｏｓ－７细胞，转染后２４，４８，７２小时分别用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＥＬＩＳＡ法及一期法测定培养细胞中ＦⅧＤＢｍＲＮＡ及ＦⅧ的含量与活性。结果：ＲＴ－ＰＣＲ法可检测到ＦⅧＤＢｃＤＮＡ转录的ｍＲＮＡ，ＥＬＩＳＡ法测得７２小时后ＦⅧ的含量为每２４小时１８ｎｇ／１０６细胞，一期法测得活性为每２４小时０．６Ｕ／１０６细胞，相当于正常人血浆中１００μｇ／ＬＦⅧ所产生的凝血活性的６０％。结论：所构建的ＦⅧ真核表达质粒在Ｃｏｓ－７细胞中具有一定的表达活性。     

一个重症vWD家系临床与基因分析

目的：研究重症血管性血友病（ｖＷＤ）患者家系成员临床表型特征，并分析血管性血友病因子（ｖＷＦ）基因缺陷的传递规律。方法：应用ｖＷＦ多聚体分析和ＥＬＩＳＡ法检测重症ｖＷＤ患者父母家系四代２６位成员临床表型。在此基础上针对ｖＷＦ基因内多个ＲＦＬＰ和ＶＮＴＲ位点，对所有家系成员进行缺陷基因遗传分析。结果：患者血浆ｖＷＦ∶Ａｇ＜２％，检测不到多聚体条带。基因分析表明两条ｖＷＦ等位基因分别来自父方和母方家系，且均有缺陷。部分家系成员携有一条缺陷基因，ｖＷＦ水平正常或有轻度下降，多聚体图谱正常。结论：①先证者可能为复合杂合子型的３型ｖＷＤ患者，携带者的缺陷基因可被正常基因弥补。②应用ｖＷＦ基因多种多态性标志行ＤＮＡ分析对重症ｖＷＤ家系遗传咨询有实用意义。     

微卫星DNADXS1113的多态性与精神分裂症

目的 搜索中国汉族人Ｘ染色体的精神分裂症（ＳＰ）易患性基因,分析ＤＸＳ１１１３多态性与ＳＰ相关性及遗传学特征。方法 运动扩增片段长度多态性（Ａｍｐ－ＦＬＰ）检测技术,分析３０例ＳＰ患ＤＸＳ１１１３二核苷酸串联重复序列的多态性分布,并以３０例正常人作为对照。结果 在对照组和ＳＰ患组中检出１２种ＤＸＳ１１１３多态性片段,ＳＰ组与对照组之间有４种片段（１５６ｂｐ、１６８ｂｐ、１７２ｂｐ、１７４ｂｐ）     

多位点VNTR用于异基基因骨髓移植植入存活检定研究

探讨多位点可变数串联重复序列（ＶＮＴＲ）－Ｄ１７Ｓ３０、ＰＡＨ、ＶＳ１７、ＭＬＯＷ１在异基因骨髓移植存活检定中的应用。方法：以聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增４个位点ＶＮＴＲ、ＰＣＲ产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测,对２名异基因骨髓移植患者作移植物成活检定研究。     

FⅧ基因内二核苷酸重复序列在中国人群中多态性的研究与血友病甲基因诊断

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）和ＤＮＡ序列分析技术对中国人群中ＦⅧ基因１３内含子（ＣＡ）ｎ二核苷酸重复序列多态性进行了研究。结果显示，中国人群中该位点存在明显的多态性，共有７种等位片段，（ＣＡ）ｎ拷贝数分别为１８，１９，２０，２１，２２，２３和２４。频率分布在０．００８～０．４９６，多态信息量为６４．６％。利用该位点的多态性对１０个甲型血友病家系进行了连锁分析，其中５个家系可用该多态性区分携带者的正常和有缺陷的ＦⅧ基因，诊断率为５０％。     

血友病Ａ的产前诊断

目的 建立简便、快速的血友病Ａ产前诊断体系。方法 用ＰＣＲ方法直接检测ＦＶⅢ内含子２２倒位或对ＦＶⅢ基因内的ＢclⅠ位点,内含子１３和２２中的ＳＴＲ和ＦＶⅢ基因外的ＤＸＳ ５２（ＳＴ１４）倍点的多态性进行遗传连锁分析。结果 ５例血友病Ａ携带者的男性胎儿有４例正常,１例为ＨＡ患者。结论 血友病Ａ的产前诊断可先进行内含子２２倒位的检测,阳性结果即可作出诊断：若内含子２２例位的检测结果阴性,则可利用ＦＶⅢ基因内、外的多个位点多态性结果进行遗传连锁分析,以得出最终的诊断。     

上海地区深静脉血栓形成患者抗活化的白蛋C及FV Leiden突变的初…

应用抗活化的蛋白Ｃ（ＡＰＣＲ）试验、多聚酶链反应－限制性内切酶长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）分析及ＤＮＡ序列分析对上海地区深静脉血栓形成（ＤＶＴ）患者ＡＰＣＲ及ＦⅤ Ｌｅｉｄｅｎ突变进行调查。正常人群正常ＡＰＣＲ敏经值（ｎ－ＡＰＣ－ＳＲ）的５％百分位数为０．７５，在被调查的３１例ＤＶＴ患者中有５例患者的ｎ－ＡＰＣ－Ｒ低于此值，ＤＶＴ患者ＡＰＣＲ的发生率为１６％，且ＤＶＴ患者与正常人的ＡＰＣＲ发生率     

人凝血因子Ⅷ cDNA 体外真核表达的初步研究

目的：建立人凝血因子ⅧｃＤＮＡ体外真核高效表达的体系。方法：将人ＦⅧＢ区大部分缺失（Δａ７６０１６３９）的ＦⅧｃＤＮＡ插入ｐＣＩ真核表达载体、ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶ载体和逆转录病毒载体ｐＭＳＣＶ，构建了５种表达框架，在体外转染和感染了多种靶细胞。结果：ｐＣＩⅧ在ＮＩＨ３Ｔ３细胞产生了低水平表达，而ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶⅧ和ｐＭＳＣＶⅧ系列分别在Ｈｅｌａ细胞和Ｂｏｓｃ２３逆转录病毒包装细胞中呈较高水平的表达。Ｂｏｓｃ２３细胞培养上清感染的ＮＩＨ３Ｔ３和３２ＤＣ不能有效地产生ＦⅧ。结论：在ＦⅧ体外表达及基因治疗的方案设计中，靶细胞的选择是一重要因素。     

D1S80位点高度多态性及其在骨髓移植中的应用

Ｄ１Ｓ８０位点是一个由核心序列组成的ＶＮＴＲ位点，具有高度多态性，高度杂合性和体细胞稳定性。种族多态性及个体多态性尤其显著。Ｄ１Ｓ８０位点作为一种个体标志应用于ＢＭＴ后的监测，灵敏度高，特异性强，且不受供者与受者性别、血型、ＨＬＡ型等巧合一致的限制。将Ｄ１Ｓ８０位点与ＡＰＯＢ３’和Ｄ１７Ｓ３０等位点进行比较，可见Ｄ１Ｓ８０位点的个人鉴别力最高。     

一例凝血因子Ⅷ1680A→C点突变

为了研究在无内含子２２倒位的甲因友病中的ＦⅧ基因的基他遗传性点突变。应用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）、单链构象多态性（ＳＳＣＰ）对５１例无内含子２２倒位的甲型血友病患者的ＦⅧ基因外显子１４３＇侧进行研究。结果发现一例遗传性点突变，密码子１６８０ＴＡ（酷）→ＴＧＴ（半胱）的突变。阐明甲型血友病的点突变有助于了解ＦⅧ蛋白各功能域的精细功能，为甲型血友病家系携带者检测和产前诊断提供一种有价值的方法。     

一例凝血因子Ⅷ1680A→G点突变

为了研究在无内含子２２倒位的甲型血友病中的ＦⅧ基因的其他遗传性点突变。应用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）、单链构象多态性（ＳＳＣＰ）对５１例无内含子２２倒位的甲型血友病患者的ＦⅧ基因外显子１４３′侧进行研究。结果发现一例遗传性点突变，密码子１６８０ＴＡＴ（酪）→ＴＧＴ（半胱）的突变。阐明甲型血友病的点突变有助于了解ＦⅧ蛋白各功能域的精细功能，为甲型血友病家系携带者检测和产前诊断提供一种有价值的方法     

STR连锁分析在Wilson病基因诊断中的应用

本文选择与Ｗｉｌｓｏｎ病致病基因紧密连锁的３个ＳＴＲ序列Ｄ１３Ｓ２２８、Ｄ１３Ｓ３０１、Ｄ１３Ｓ１３７为遗传标记，用扩增片段长度多态性（Ａｍｐ－ＦＬＰ）方法对中国人群的多态性进行了检测，发现具有高度多态性，多态信息量（ＰＩＣ）分别为０．６０、０．７８、０．７９，联合这３个ＳＴＲ序列对２个ＷＤ家系进行单体型连锁分析，确定了家系各成员的基因型。表明ＳＴＲ连锁分析可对ＷＤ家系进行症状前及产前基因诊断。     

一例凝血因子Ⅷ B区错义突变导致重型血友病A

目的：检测一例重型血友病Ａ患者（ＳＨ９）的基因突变。方法：用ＰＣＲ、变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和ＤＮＡ测序检测因子Ⅷ基因突变。先用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ排除内含子２２倒位，然后应用ＰＣＲ对凝血因子Ⅷ基因进行扩增。扩增范围包括所有外显子及其侧翼内含子序列。结果：片段１４２在ＤＧＧＥ中泳动异常。ＤＮＡ测序证实Ｃ２５３５Ａ导致Ｂ区错义突变８２６Ａｓｐ（ＧＡＣ）→Ｇｌｕ（ＧＡＡ）。结论：该突变可能是导致重型血友病Ａ的原因，但有待进一步研究证实。     

骨髓增生异常综合征DCC基因的微卫星不稳定性和杂合性缺失

为研究骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）病情进展中是否发生基因改变，用ＰＣＲ及限制性酶谱分析１７例ＭＤＳ患者骨髓ＤＮＡ的ＤＣＣ抗癌基因中的微卫星（ＴＡ）２６Ｎ２８（ＡＴ）８序列和多态性Ｄ１８Ｓ８位点，探索基因的微卫星序列的不稳定性和杂合性缺失（ＬＯＨ）与ＭＤＳ骨髓异常细胞克隆演化的关系。发现１７例ＭＤＳ中１１例患者微卫星序列出现微卫星序列的不稳定性（６５％）。１１例数月后转化为急性白血病或原始细胞增多的ＭＤＳ患者中８例有明确的微卫星序列不稳定性（７３％）。５例ＤＣＣＤ１８Ｓ８信息个体４例（８０％）出现ＬＯＨ。说明ＭＤＳ的恶性演化与基因组的复制和修复错误及等位基因的缺失有明显的关系     

可变串联重复区多聚酶链反应法评估异基因骨髓移植后的嵌合状态

为更好地评价异基因骨髓移植（ａｌｏ－ＢＭＴ）后的嵌合状态，采用可变串联重复区（ＶＮＴＲ）Ｄ１Ｓ８０位点多聚酶链反应（ＰＣＲ）法对１０例白血病患者ａｌｏ－ＢＭＴ后的嵌合状态进行检测。结果９例为完全嵌合（ＣＣ），１例为混合嵌合（ＭＣ），其中２例经核型分析结果证明为ＣＣ，６例经小卫星ＤＮＡ探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析也证明为ＣＣ。说明ＶＮＴＲ位点ＰＣＲ法检测ａｌｏ－ＢＭＴ后的嵌合状态具有方法简便、快速、灵敏度高的优点，且不需放射性同位素操作，不受血型、性别、ＨＬＡ配型及骨髓增生低下等影响。     

3型血管性血友病的基因突变与临床研究

目的：研究３型血管性血友病（ｖＷＤ）的分子病理机制。方法：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）筛选了３型ｖＷＤ患者ｖｏｎＷｉｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）基因编码区的基因突变，对ＰＣＲ－ＤＧＧＥ行为发生改变的片段直接进行ＤＮＡ序列分析。结果：检测到１例基因突变，在ｖＷＦ基因外显子３第２１２号核苷酸，发生了Ｃ→Ａ的替换，使Ｓｅｒ７１突变为终止密码子。该突变创造了ＸｂａⅠ酶切位点，消除了原有的ＴａｑⅠ位点。结论：ＰＣＲ－ＤＧＧＥ和酶切分析均证实，患者为该突变的纯合子，其父母则均为该突变的携带者。