人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

目的：构建人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa（GPIIb／IIIa）Fab噬菌体抗体库,筛选抗GPIIb／IIIa特异性的噬菌体抗体,并对其功能进行研究。方法：取血小板膜糖蛋白抗体（抗GPIIb／IIIa）阳性的特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者脾细胞,采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPIIb／IIIa Fab噬菌体抗体库,以表达GPIIb／IIIa的CHO123细胞筛选抗体库,并以ELISA法检测噬菌体抗体;用Western blot对抗体进行鉴定,并测定其与血小板抗原的结合;观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响。结果：筛选出2株能够与血小板膜GPIIb／IIIa特异性结合的Fab抗体,其序列与人免疫球蛋白轻、重链可变区序列具有高度同源性,表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集。结论：成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体库筛选出特异性识别GPIIb／IIIa,具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体。     

中华眼镜蛇毒F组分抗血小板聚集的作用机制

目的探讨中华眼镜蛇毒F组分抑制血小板聚集的作用机制。方法用比浊法测定中华眼镜蛇毒F组分对二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导血小板聚集作用的影响,流式细胞术观察中华眼镜蛇毒F组分对荧光标记的单克隆抗体CD41(FITC-CD41)和CD61(FITC-CD61)与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)结合的影响。结果中华眼镜蛇毒F组分明显抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导的血小板聚集,其作用呈现一定程度的剂量依赖关系。中华眼镜蛇毒F组分可以明显降低单克隆抗体CD41(抗GPIIb)与血小板的结合率,而对单克隆抗体CD61(抗GPIIIa)与血小板的结合率没有影响。结论中华眼镜蛇毒F组分可以抑制多种激动剂诱导的血小板聚集,其机制和中华眼镜蛇毒F组分与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa复合物的结合有关。     

血小板无力症与GPIIb-IIIa分子缺陷

血小板膜糖蛋白GPIIb IIIa复合物是在血小板粘附聚集过程中起重要作用的粘附分子受体 ,能结合纤维蛋白原、VWF等多种粘附蛋白。GPIIb IIIa质或量的缺陷导致血小板无力症 ,根据GPIIb IIIa缺陷程度分为I,II,III型 ,临床表现为出血时间延长 ,聚集反应明显减弱。GPIIb IIIa的研究已进入分子水平 ,对其发病机制也有较深的了解     

特发性血小板减少性紫癜患者GPIIb/IIIa、CD62P表达探讨

目的检测原发性血小板减少性紫癜 (ITP)患者血小板表面GPIIb/IIIa、CD62P的表达情况 ,以探讨其在ITP患者中的临床应用价值。方法采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪 ,对32例ITP患者、17例非免疫性血小板减少、21例其它自身免疫性疾病及20例健康正常人的血小板表面GPIIb/IIIa、CD62P的表达情况进行了分析测定。结果ITP患者GPIIb/IIIa血小板阳性表达率明显高于其它三组 (P<0.01) ,但CD62P血小板阳性表达率四组无明显差别(P>0.05) ,15例无临床症状ITP患者GPIIb/IIIa表达明显高于17例有临床症状ITP患者的表达(P<0.01)。结论GPIIb/IIIa作为监测血小板活化指标 ,对ITP的鉴别诊断及监测病情发展、判断预后具有重要意义 ;ITP患者的GPIIb/IIIa表达明显增高 ,但CD62P表达并不增高 ,CD62P并非监测ITP患者循环中活化血小板的理想标志物     

抗血小板糖蛋白IIb/IIIa Fab抗体的原核表达及其生物活性

目的 :研制抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIaFab抗体。方法 :通过间接免疫荧光试验和血小板聚集抑制试验 ,选取鼠源抗血小板糖蛋白IIb/IIIa单克隆抗体 (mAbP14 0 )。从分泌该mAb的杂交瘤细胞株 (P14 0 )中 ,克隆到抗体轻链基因和重链Fd段基因 ,构建原核表达重组质粒p3MH/P14 0к Fd ,并在XLI Blu菌株中进行表达。采用钴亲和层析法对P14 0Fab抗体进行纯化 ,用SDS PAGE、ELISA和Westernblot等方法 ,对P14 0Fab抗体进行检测 ,并通过血小板聚集抑制试验 ,观察P14 0Fab抗体的抗栓活性。结果 :SDS PAGE和Westernblot表明 ,纯化的P14 0Fab抗体的相对分子质量 (Mr)约为 4 70 0 0。ELISA的结果显示 ,P14 0Fab抗体可与人血小板特异性结合。在体外ADP诱导的血小板聚集试验中 ,P14 0Fab抗体对血小板聚集的抑制作用成剂量依赖性 ,IC50 的平均值为 16 .85mg/L。结论 :成功地研制出具有抗栓活性的抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa的Fab抗体     

人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa Fab噬菌体抗体库的构建

目的:构建人源性Fab噬菌体抗体库,为进一步从抗体库中筛选人源性抗GPIIb/IIIaFab抗体奠定基础。方法:利用RT-PCR和噬菌体表面展示技术,直接从血小板膜糖蛋白抗体(抗-GPIIb/IIIa)阳性的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者脾细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA,扩增抗体轻链和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次将PCR产物插入噬粒载体pComb3H相应位点,电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建成人源性Fab噬菌体抗体库。结果:成功地构建库容量达6.2×106的抗血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIaFab噬菌体抗体库。结论:构建了人源性Fab抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选人源性Fab抗体。     

中华眼镜蛇毒F组分抗血小板聚集的作用机制

目的 探讨中华眼镜蛇毒F组分抑制血小板聚集的作用机制.方法 用比浊法测定中华眼镜蛇毒F组分对二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导血小板聚集作用的影响,流式细胞术观察中华眼镜蛇毒F组分对荧光标记的单克隆抗体CD41(FITC-CD41)和CD61(FITC-CD61)与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)结合的影响.结果 中华眼镜蛇毒F组分明显抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导的血小板聚集,其作用呈现一定程度的剂量依赖关系.中华眼镜蛇毒F组分可以明显降低单克隆抗体CD41(抗GPⅡb)与血小板的结合率,而对单克隆抗体CD61(抗GPⅢa)与血小板的结合率没有影响.结论 中华眼镜蛇毒F组分可以抑制多种激动剂诱导的血小板聚集,其机制和中华眼镜蛇毒F组分与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的结合有关.     

血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体拮抗剂RGDS肽类作为抗…

位于纤维蛋白原上的ＲＧＤ肽片段是血小板糖蛋白Ⅱｂ／Ⅲａ复合物的识别位点，两者的结合是血栓形成的最后共同通路。合成的ＲＧＤ肽类物质作为血小板糖蛋白Ⅱｂ／Ⅲａ受体拮抗剂，有效地抑制血小板粘附，聚集与阻止血栓形成，对于心脑血管疾病的防治具有重要的潜在临床应用价值。     

生理性流动条件下血小板在玻璃表面的聚集行为

目的 研究生理性流动条件下血小板在玻璃表面的聚集行为。方法 采用软光刻工艺加工聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)-玻璃微通道芯片。将抗凝人外周全血以300、1 500 s^-1壁剪切率流过微通道芯片,倒置荧光显微镜拍摄荧光标记血小板在微通道玻璃表面形成的血小板聚集体荧光图像,通过图像分析得到血小板聚集体数量、平均尺寸、表面覆盖率和平均荧光强度。分别对玻璃表面进行亲水性处理、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)封闭和胶原纤维蛋白修饰处理,调整血液样品红细胞比容(hematocrit, Hct),用抗血小板制剂处理血液样品,观察上述条件下血小板在玻璃表面的聚集行为;比较分析健康人群和糖尿病患者的血小板聚集情况。结果 流动条件下,血小板在玻璃表面发生聚集形成三维血小板聚集体;血小板聚集依赖于壁剪切率大小、玻璃表面亲疏水性和Hct;血小板聚集主要由血小板膜糖蛋白GPIIb/Ⅲa-纤维蛋白原和ADP-P2Y₁₂受体通路调控;血小板在玻璃表面的聚集能够反映糖尿病患者血小板的高活化状态。结论 ...     

抗血小板糖蛋白VI单克隆抗体的制备及其功能研究

目的:制备抗血小板糖蛋白VI(GPVI)单克隆抗体,观察其在体外抗血小板黏附和聚集功能。方法:采用基因重组技术体外表达血小板糖蛋白VI胞外区重组蛋白(rGPVI)。以rGPVI免疫小鼠,经细胞融合及筛选后制备抗GPVI单克隆抗体。采用血小板聚集实验观察该单抗对胶原、Convu lxin及ADP诱导的血小板聚集的影响;利用平行板流动小室技术研究在高剪切力条件下该单抗对血小板在胶原表面黏附的抑制效果。结果:正确构建了rGPVI表达载体pET-20b(+)-GPVI,rGPVI在原核细胞中有效表达。rGPVI能够被抗Penta-H is单抗和抗GPVI多抗识别。制备的抗GPVI单克隆抗体SZ118能够识别rGPVI,并与血小板有特异的结合能力。SZ118能明显抑制纤维状胶原和Convu lxin诱导的血小板聚集,呈抗体剂量依赖性;对ADP诱导的血小板聚集无明显影响。血小板黏附实验表明,SZ118能够明显阻断在高剪切力条件下血小板与纤维状胶原表面的黏附。结论:成功制备抗GPVI单克隆抗体SZ118,该抗体与血小板有良好的结合能力,显著抑制胶原诱导的血小板聚集并明显降低血小板与胶原的黏附反应。     

假性血小板减少症分析前的质量控制

假性血小板减少症（pseudothrombocytopenia,PTCP）是由于在EDTA（枸橼酸盐、肝素等）作为抗凝剂的前提下出现的免疫介导的血液中冷抗血小板自身抗体,使血小板互相聚集现象,这种EDTA依赖的冷抗血小板自身抗体直接作用于血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa上,同时,这种与血小板结合的自身抗体Fc端可与单核细胞或淋巴细胞膜上Fc受体结合,     

天麻提取物对血小板聚集的影响

目的观察天麻提取物对家兔体外、大鼠半离体和小鼠体内血小板聚集的影响.方法用比浊法测定血小板的聚集率.结果在体外、半离体和体内实验中,天麻提取物G2能抑制由二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集;在体外实验中,天麻提取物G2还能抑制由血小板活化因子（PAF）诱导的血小板聚集.结论天麻提取物G2具有显著的抗血小板聚集作用.     

血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体拮抗剂RGDS肽类作为抗栓剂的研究

位于纤维蛋白原上的ＲＧＤ肽片段是血小板糖蛋白Ⅱｂ／Ⅲａ复合物的识别位点，两者的结合是血栓形成的最后共同通路。合成的ＲＧＤ肽类物质作为血小板糖蛋白Ⅱｂ／Ⅲａ受体拮抗剂，有效地抑制血小板粘附、聚集与阻止血栓形成，对于心脑血管疾病的防治具有重要的潜在临床应用价值。     

抗血小板单克隆抗体片段的抗栓效应研究

目的 :研究抗血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)单克隆抗体 (mAb)SZ 2 1F(ab′) 2 片段的抗血栓效应。方法 :用木瓜蛋白酶在偏酸条件下 ( pH5 .5 )消化 2 0h ,经DEAE 5 2NaCl梯度洗脱消化产物 ,以得到F(ab′) 2 片段。收集产物经SDS PAGE鉴定 ,并通过ELISA和血小板聚集抑制试验 ,观察所获F(ab′) 2 片段免疫原活性和抗栓活性。结果 :该法制备F(ab′) 2 片段的得率为 6 0 .32 % ;酶免法测定其效价为 0 .8× 10 -9mol/L ;体外血小板聚集抑制半数有效剂量 (ED5 0 )为 3.395mg/L。F(ab′) 2 片段与血小板的结合性及对血小板聚集功能的抑制效果均高于完整的IgG。 结论 :利用木瓜蛋白酶制备的抗血小板mAbSZ 2 1的F(ab′) 2 片段 ,产率高且其抗栓活性与免疫原活性均优于完整的mAbIgG ,为mAbSZ 2 1用于临床抗血栓治疗展现了良好的前景     

刺五加注射液对大鼠血小板聚集的影响

刺五加注射液能明显降低ADP诱导的大鼠体内、外血小板聚集功能,抑制程度与复方丹参注射液无显著性差异。给药组中多个样本ADP诱导血小板聚集的第一相波消失,第二相波明显降低,表明二者可抑制血小板变形,减少受体暴露,同时减少血小板内源性活性物质的释放。     

ADP脱敏对兔血小板ADP受体调节的影响

用ADP引起兔血小板脱敏,测定血小板上ADP受体的K_D及数目,并与正常血小板上的数据比较。正常血小板的K~D=0.0129nM,受体数=857.69;而脱敏血小扳的K′_D=0.0265nM,受体数=294.78。以上结果说明由于细胞表面受体的内化,使受体亲和力及受体数目减少。     

柚皮素通过PI3K/Akt通路拮抗血小板聚集的体外研究

目的:探讨柚皮素拮抗二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的作用及机制。方法:采用血小板聚集仪观察不同浓度柚皮素对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响。采用荧光显微镜观察柚皮素对血小板在固化纤维蛋白原上扩展功能的影响。采用Western blot检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)表达及蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平。结果:柚皮素能剂量依赖性地抑制ADP诱导的体外血小板聚集,其半数抑制浓度(IC_(50))值为(132.1±31.7)μmol/L。柚皮素灌胃给药,对ADP诱导的大鼠体内血小板聚集也有明显的抑制作用。柚皮素还能显著抑制血小板在固化纤维蛋白原上的扩展。Western blot结果显示,柚皮素能明显抑制ADP刺激的PI3K表达和Akt磷酸化同时,PI3K广谱抑制剂LY294002能增强柚皮素对Akt磷酸化的抑制作用。结论:柚皮素可能通过抑制血小板PI3K/Akt信号通路发挥抗血小板聚集的作用。     

抗血小板糖蛋白Ⅵ单克隆抗体的制备及其功能研究

目的：制备抗血小板糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）单克隆抗体，观察其在体外抗血小板黏附和聚集功能。方法：采用基因重组技术体外表达血小板糖蛋白Ⅵ胞外区重组蛋白（rGPⅥ）。以rGPⅥ免疫小鼠，经细胞融合及筛选后制备抗GPⅥ单克隆抗体。采用血小板聚集实验观察该单抗对胶原、Convulxin及ADP诱导的血小板聚集的影响；利用平行板流动小室技术研究在高剪切力条件下该单抗对血小板在胶原表面黏附的抑制效果。结果：正确构建了rGPⅥ表达载体pET-20b（＋）-GPⅥ，rGPⅥ在原核细胞中有效表达。rGPⅥ能够被抗Penta-His单抗和抗GPⅥ多抗识别。制备的抗GPⅥ单克隆抗体SZ118能够识别rGPⅥ，并与血小板有特异的结合能力。SZ118能明显抑制纤维状胶原和Convulxin诱导的血小板聚集，呈抗体剂量依赖性；对ADP诱导的血小板聚集无明显影响。血小板黏附实验表明，SZ118能够明显阻断在高剪切力条件下血小板与纤维状胶原表面的黏附。结论：成功制备抗GPⅥ单克隆抗体SZ118，该抗体与血小板有良好的结合能力，显著抑制胶原诱导的血小板聚集并明显降低血小板与胶原的黏附反应。     

抗血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体的原核表达及其生物活性

目的：研制抗血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa Fab抗体。方法：通过问接免疫荧光试验和血小板聚集抑制试验，选取鼠源抗血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa单克隆抗体(mAb P140)。从分泌该mAb的杂交瘤细胞株(P140)中，克隆到抗体轻链基因和重链Fd段基因，构建原核表达重组质粒p3MH／P140x-Fd，并在XLI-Blu菌株中进行表达。采用钴亲和层析法对P140 Fab抗体进行纯化，用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法，对P140 Fab抗体进行检测，并通过血小板聚集抑制试验，观察P140 Fab抗体的抗栓活性。结果：SDS-PAGE和Western blot表明，纯化的P140Fab抗体的相对分子质量(Mr)约为47000。ELISA的结果显示，P140 Fab抗体可与人血小板特异性结合。在体外ADP诱导的血小板聚集试验中，P140 Fab抗体对血小板聚集的抑制作用成剂量依赖性，IC50的平均值为16．85mg/L。结论：成功地研制出具有抗栓活性的抗血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的Fab抗体。     

抗血小板糖蛋白单克隆抗体的纯化及生物活性鉴定

原核表达重组质粒p3MH/P140?Fd,在E.coli XLI-Blue菌中获得了成功表达,利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的"标签"进行亲和层析,对表达产物进行纯化.SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot的检测结果证明,纯化得到的分子量约47kD蛋白是鼠源性的Fab抗体,ELISA检测结果证明,P140Fab抗体与人血小板能特异性结合.体外二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集抑制试验证明,P140Fab抗体对血小板的聚集有抑制作用,并且具有剂量抑制效应,IC50的平均值为16.85mg/L.