间充质干细胞的免疫调节可塑性及其临床应用策略

间充质干细胞(MSCs)是具有自我更新、多向分化和免疫调节能力的多能干细胞。越来越多的研究证明了MSCs在免疫紊乱相关疾病治疗中的有益作用。然而体内获取或体外培养的MSCs的免疫调节能力都存在异质性，MSCs的免疫调节能力也会受到微环境的调控。本综述概述MSCs的免疫抑制能力和免疫支持能力的机制，介绍最近关于MSCs免疫调节机制的研究及其免疫调节能力可塑性假说，并讨论在细胞生产阶段增强MSCs免疫调节能力的策略，以期为MSCs临床转化研究提供参考。     

间充质干细胞与自身免疫病研究进展

间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员,其源于发育早期的中胚层和外胚层.MSCs最初在骨髓中发现,因其具有多向分化潜能、造血支持和自我复制等特点而日益受到人们的关注.近年来,因其低免疫原性和免疫调节作用的研究发现,进而揭开了MSCs在治疗自身免疫性疾病中的广阔前景.因而研究MSCs、表面标志、诱导分化、免疫调控作用以及在自身免疫性疾病中的应用和机制具有重要意义.     

骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖的影响

骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是不同于造血干细胞的另一类骨髓干细胞。近年对MSCs的研究初步显示其能减少骨髓移植后移植物抗宿主病的发生，并推测它具有免疫抑制作用。为了解成人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用，我们观察了在无细胞接触的条件下，MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖的影响。     

间充质干细胞免疫调节作用研究进展

骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）是骨髓中的多能祖细胞，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等多种结缔组织分化的性质，并可支持造血。体外试验和异基因移植研究中均显示，MSCs具有较强的免疫调节功能，近年来对MSCs的免疫调节及其临床应用的研究取得了较大进展。     

大鼠骨髓间充质干细胞对T细胞免疫活性的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stemcells,MSCs)对脾脏T细胞的免疫调节作用。方法:从大鼠骨髓中分离培养间充质干细胞,通过瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态,并用流式细胞术(Flowcytometry,FCM)检测其细胞表面特征分子表达情况。MTT法测定经刀豆蛋白A(ConA)刺激后,不同数量MSCs对T细胞增殖能力的影响;ELISA法检测MSCs对T细胞分泌IFN-γ和IL-4水平的影响。FCM检测MSCs对脾脏T细胞凋亡水平的影响。MTT法测定MSCs对细胞毒性T细胞(Cytotoxic Tcells,CTL)杀伤活性的影响。结果:经不同数量MSCs作用后,脾脏T细胞增殖水平明显低于阳性对照组(P<0.01),而且MSCs比例越高,其抑制作用越强(P<0.01)。经MSCs作用后,T细胞分泌IFN-γ的水平明显降低,而分泌IL-4的水平明显升高,且这种作用随MSCs比例的增加而增强(P<0.01)。MSCs能够抑制在体外培养过程中T细胞的自发凋亡。与MSCs共培养后,T细胞对L1210细胞的杀伤活性和单独培养组相比明显下降(P<0.05)。结论:MSCs能够抑制T细胞增殖反应和CTL活性,该作用可能与MSCs改变T细胞分泌细胞因子水平有关,但与诱导T细胞凋亡无关。     

骨髓间质干细胞下调免疫反应的实验研究

目的：研究骨髓间质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）下调免疫反应的作用及其机制.方法：采用流式细胞分析（FCM）鉴定MSCs的纯度,用^3H-TdR掺入法测定MSCs对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响,利用RT-PCR和Real-time PCR检测TGF-β1、IL-8、IL-10的基因表达,同时进行皮肤移植模型研究.结果：MSCs对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响与MSCs和淋巴细胞的比值有关.RT-PCR结果显示MSCs对淋巴细胞分泌TGF-β1无显著性影响,而Real-time PCR的结果显示MSCs促进淋巴细胞分泌IL-10,减少淋巴细胞分泌IL-8.皮肤移植实验显示MSCs能延长异种移植皮肤的存活时间.结论：MSCs能下调免疫反应和抑制皮肤移植排斥反应,其可能的机制是通过促进淋巴细胞分泌IL-10以及减少淋巴细胞分泌IL-8来发挥作用.     

芳香烃受体调控人脂肪间充质干细胞的免疫调节功能

目的 探索芳香烃受体(AHR)对人脂肪间充质干细胞(MSCs)免疫调节功能的影响。方法 RT-qPCR和免疫荧光染色法检测炎性细胞因子刺激前后，MSCs中吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、白细胞介素-4诱导基因1(IL4I1)和芳香烃受体表达水平；将si-Ctrl、si-IDO1、si-IL4I1、si-AHR转染至MSCs,阻断AHR信号通路；将MSCs的条件培养基与巨噬细胞共培养，RT-qPCR和ELISA检测巨噬细胞炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。结果 未经细胞因子刺激的MSCs高表达AHR,几乎不表达IDO和IL4I1蛋白；不同细胞因子刺激后，代谢酶IDO1、IL4I1及AHR表达上调(P<0.05),IFN-γ刺激后IDO1、IL4I1表达上调最为显著(P<0.001),进入细胞核的AHR增多；下调AHR的表达削弱MSCs的免疫抑制作用(P<0.05)。结论 AHR参与调节MSCs的免疫功能，下调AHR可以抑制MSCs的免疫调节作用。     

骨髓MSCs对GVHD模型大鼠的免疫调节作用

目的探讨骨髓源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)模型大鼠的免疫调节作用。方法从SD大鼠骨髓中分离培养MSCs。通过给放射线照射过的Wistar大鼠进行干细胞和单个核细胞(mononuclear cell,MNC)共同移植,建立大鼠GVHD模型,对其进行异基因骨髓移植的同时,共输注不同数量的供者源性的MSCs,观察受鼠的一般表现、生存期及病理损伤的变化;利用细胞免疫化学检测各实验组大鼠外周血MNC中Foxp3+细胞比例的变化,应用ELISA方法检测实验各组大鼠外周血血清中细胞因子IFN-γ、IL-4的变化,诱导各组受鼠脾脏MNC为CTL,并用MTT法检测各组受鼠CTL的杀伤活性。结果异基因骨髓移植时,共输注供鼠MSCs能够明显降低GVHD的发生率,并减轻其病理损伤,延长生存时间;共输注MSCs受鼠血清中IFN-γ水平明显减低而IL-4水平明显增加(P<0.05),与GVHD组大鼠相比,共输注MSCs的各组大鼠外周血中Foxp3+细胞比例明显增加(P<0.05),而CTL杀伤活性明显减弱。结论 MSCs能够通过免疫调节作用抑制GVHD的发生,降低其严重程度,并延长受鼠生存时间。     

大鼠骨髓间充质干细胞对脾单个核细胞的免疫调节作用

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对脾单个核细胞(MNC)的免疫调节作用,并初步探讨其作用机制.方法:从大鼠骨髓中分离培养间充质干细胞,通过瑞氏-姬姆萨染色进行形态学观察.应用流式细胞术(FCM)检测鉴定其细胞表面特征分子.以刀豆蛋白A(ConA)作为刺激原,用MTT法测定不同数量MSCs对脾MNC增殖能力的影响.ELISA法检测MSCs对脾MNC分泌IL-2和IL-10水平的影响.用FCM分析MSCs对脾MNC细胞周期分布以及p27、cyclin E表达水平的影响.用乳酸脱氢酶释放法检测MSCs对脾MNC杀伤活性的影响.结果:经不同数量的MSCs作用后,脾MNC增殖水平明显低于阳性对照组(P<0.01),而且MSCs比例越高,其抑制作用越强(P<0.01).经MSCs作用后,脾MNC分泌IL-2的水平明显降低,而分泌IL-10的水平明显升高(P<0.01),且这种作用随MSCs比例的增加而增强.在ConA刺激下,MSCs可以使脾MNC阻滞于G_0/G_1期,抑制其进入S期(P<0.01).MSCs可使脾MNC表达p27的水平明显上升,cyclin E表达的水平明显下降(P<0.05).与MSCs共培养后,脾MNC对colon26和H22细胞的杀伤活性和单独培养组相比明显下降(P<0.05).结论:MSCs能够抑制脾MNC体外增殖,该作用可能与MSCs改变MNC分泌细胞因子的水平及其对MNC细胞周期的调节有关.     

间充质干细胞在T细胞免疫反应中的调节作用

间充质干细胞(MSCs)独特的免疫调节作用以T细胞为主,在混合淋巴细胞反应中,通过周期阻滞抑制T细胞增殖,但不引起T细胞凋亡增加、活化受抑。同时MSCs还能降低反应体系中的CD8+T细胞和Th1细胞,升高Th2细胞以抑制炎症反应,从而在T细胞介导的自身免疫性疾病中发挥治疗作用。     

骨髓间充质干细胞对致脑脊髓炎性MBP68-86特异性T淋巴细胞的调节作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对致脑脊髓炎性MBP68-86-特异性T淋巴细胞的抑制和激活作用.方法 全骨髓贴壁法提取、培养Lewis大鼠股骨、胫骨内的MSCs;建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型,对照组大鼠仅免疫完全弗氏佐剂(CFA);EAE大鼠免疫10～11 d后,MBP68-86特异性T淋巴细胞被取出进行体外T淋巴细胞增值试验.从Lewis大鼠中得到的间质干细胞分别按下列要求预培养:在24孔板中与T细胞比值:1:1(1×106骨髓基质细胞/T细胞1×106)1:5、1:10、1:50或1:100;ELISA方法检测淋巴细胞培养上清液.结果 同种同基因的MSCs以MSCs与效应T细胞比例为1:1、1:5、1:10时共培养能够显著抑制MBP68-86特异性T淋巴细胞的增殖能力,与没有加入MSCs的单独MBP68-86特异性T淋巴细胞组相比差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 MSCs在高密度(MSCs/T细胞数比≥1:10)的情况下,对MBP68-86-特异性T细胞表现为抑制作用;在较低的密度(≤1:50)时,表现为刺激的作用.     

干细胞移植治疗脓毒症的研究进展

脓毒症是以全身炎症反应综合征为表现的一组临床综合征,现有的治疗方法不能取得满意的疗效,死亡率仍然居高不下.研究证实,骨髓间充质干细胞(MSCs)具有再生修复功能和强大的免疫调节以及抗炎功能.借此干细胞移植能从整体上调节宿主免疫和炎症反应,同时还能修复受损的组织和器官,有望成为脓毒症救治的新希望.     

HO-1修饰的大鼠骨髓间充质干细胞在体外对淋巴细胞的影响北大核心CSCD

目的：探讨血红素加氧酶1（HO-1）修饰的大鼠骨髓间充质干细胞（BM MSCs）在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法体外分离培养和鉴定BM MSCs ,用载有HO-1基因的重组腺病毒载体进行感染,形成HO-1/BM MSCs,与大鼠脾淋巴细胞共培养。 MTT法检测淋巴细胞的增殖活性,碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期的分布情况,ELISA法检测细胞因子含量,流式细胞仪分析T淋巴细胞CD25、CD71的表达。结果 HO-1/BM MSCs参与共培养的淋巴细胞的增殖活性和细胞周期进程均被抑制、促炎因子（ IL-2、TNF-α和IFN-γ）的分泌量降低、抗炎因子（ IL-10）的分泌量升高、T淋巴细胞CD25和CD71的表达降低,与BM MSCs组相比差异有统计学意义。结论 HO-1/BM MSCs较BM MSCs能够更好地发挥对淋巴细胞的免疫调节作用。     

多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞免疫调节功能异常及其在骨髓瘤骨病中的作用

目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)免疫调节功能及其对骨髓瘤骨病的影响.方法 分离MM患者和正常对照MSCs,流式细胞技术比较二者的免疫表型.Real-time PCR检测实验组及对照组MSCs的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-6、IL-3、TNF-α、FasL和NF-κB配体的受体激活物(RANKL)表达量.共培养系统与流式细胞术检测MSCs对T细胞增殖、凋亡和早期活化标志CD25和CD69表达的影响.Von kossa染色、real-time PCR和Western blot等技术检测T细胞对正常对照MSCs向成骨细胞分化的影响.结果 MM来源和正常对照MSCs具有相似的形态学和免疫表型.MM来源的MSCs表达TGF-β1、IL-6、IL-3、TNF-α和RANKL较正常对照MSCs增加,而TGF-β2、TGF-β3和FasL的表达下降.MM来源的MSCs对T细胞增殖的抑制作用明显减弱.正常对照MSCs较MM来源MSCs使更多T细胞静止于G0/G1期.正常对照MSCs明显促进T细胞凋亡,而MM来源的MSCs对T细胞的促凋亡作用减弱.正常对照MSCs明显抑制T细胞活化分子表达,而MM患者的MSCs此抑制作用明显降低.与MM患者的MSCs共培养后的T细胞以及直接来源于MM患者的T细胞均可以明显抑制正常对照MSCs向成骨细胞分化.结论 MM患者的MSCs免疫调节功能较正常对照MSCs降低,主要表现为抑制T细胞活化的功能减弱,而活化的T细胞可抑制MSCs向成骨细胞分化,此可能为骨髓瘤骨病发病机制之一.     

骨髓间充质干细胞培养上清液抑制异体淋巴细胞增殖

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）作为具有多向分化潜能的干细胞,具有广泛的临床应用前景。近年来的研究已经证实,MSCs具有免疫负调节作用,但其具体机制尚不清楚。我们试图通过研究MSCs培养上清液对异体淋巴细胞增殖的影响,观察MSCs的免疫调节作用,进一步探讨MSCs的免疫调控机制。     

骨髓间充质干细胞免疫调节机制的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(MSCs)上的吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)活性对异基因T淋巴细胞增殖的影响,进而探讨MSCs的免疫调节机制。方法:从人骨髓中分离培养MSCs,并通过其形态的均一性及流式细胞术检测表面标志以鉴定其纯度。经200U/ml IFN-γ作用后的MSCs以RT-PCR和Western blot分别检测IDO mRNA和IDO蛋白表达。有或无1-甲基色氨酸(1-MT)存在下,分别以1×105、5×104、1×104、5×103个MSCs与5×105个外周血异基因T淋巴细胞(MSCs∶T数量比为1∶5、1∶10、1∶50、1∶100)建立混合淋巴细胞培养体系(MLR),以单独培养T淋巴细胞为对照组,MTT法检测T淋巴细胞增殖率,反相高效液相色谱法检测各MLR体系上清中IDO活性。结果:IFN-γ作用后的MSCs出现IDO mRNA和IDO蛋白的表达。当MSCs为1×105、5×104、1×104(即MSCs∶T为1∶5、1∶10、1∶50)时,与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率显著降低,IDO活性显著升高;加入1-MT后,T淋巴细胞的增殖率及IDO活性均恢复。当MSCs为5×103(即MSCs∶T为1∶100)时,与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率轻度升高(P>0.05),IDO活性无明显变化(P>0.05)。结论:MSCs通过IDO活性在体外发挥免疫抑制作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞和免疫调节作用

目的 研究一氧化氮(nitric oxide,NO)在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的免疫调节作用.方法 贴壁筛选法分离培养Lewis大鼠骨髓间充质干细胞.以刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)作为刺激因素,SD大鼠外周血分离的T淋巴细胞作为反应细胞,采用CCK-8法检测T淋巴细胞与MSCs共培养后其增殖能力的变化.然后采用RT-PCR、Western blot检测MSCs诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA与蛋白的表达;Griess法检测上清液亚硝酸盐含量;ELISA检测上清液Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4的水平.结果 MSCs明显抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖,抑制作用因细胞比例的不同而有所区别.当实验组MSC:T为1:10时最明显,增殖率为(33.83±2.10)%,而1:80组[(78.62±3.80)%]与不含MSCs的阳性对照组[(79.03±1.70)%]差异无统计学意义(P＞0.05).实验组MSCs的iNOS mRNA与蛋白的表达以及上清液中亚硝酸盐含量均较阳性对照组明显上调,1:10～1:40的范围内呈明显递增趋势,但1:80组与1:40组差异无统计学意义(P＞0.05).在加入iNOS特异性抑制剂2-甲基-2-巯基硫酸脲(S-methylisothiourea sulfate,SMT)后,各组T淋巴细胞增殖率基本恢复.实验组IFN-γ含量随MSCs所占比例的降低而增加,各组IL-4含最差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MSCs对同种异体外周血T淋巴细胞的增殖有免疫调节作用,机制可能与其分泌的可溶性因子NO影响了 Th1/Th2平衡有关.

Abstract：

Objective To observe the role of nitric oxide(NO) in the immune regulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs). Methods Bone marrow MSCs were isolated from Lewis rats by adherence screening. Concanavalin A (ConA) was adopted as the stimulator and T-lymphocyte isolated from peripheral blood of SD rats as the reactive cells. The changes of the ability of T-lymphocyte proliferation, when co-cultured with MSCs, were measured by CCK-8 assay. The inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA and protein expression on MSCs and were detected by RT-PCR, Western blot. The contents of nitrites and the levels of Th1 type cytokine IFN-γand Th2 type cytokine IL-4 were measured by Griess test and ELISA respectively, in the co-cultured supernatant. Results T-lymphocyte proliferation was inhibited by co-cultured MSCs, which was concentration-dependent. In this study, the inhibition was most obviously group[ (79.03 ± 1.70)% ] (P ＞ 0.05 ). The I NOS mRNA expression, protein and nitrite levels were signifigroups, the proliferation rate of T-lymphocyte recovered. The content of IFN-γwas increased with the ratio decline of MSCs in the experimental group and IL-4 in each group has no significant difference( P ＞ 0.05 ).Conclusion MSCs inhibited T-lymphocyte proliferation by influencing Th1/Th2 balance, and the secretion of soluble factor NO, which secreted by MSCs, may plays an important role in the immune regulation.     

骨髓和脂肪来源的间充质干细胞免疫调节作用的比较

目的比较脂肪源间充质干细胞(AMSCs)和骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)的免疫调节能力的差异。方法用流式细胞仪分析AMSCs和BMSCs的表型。通过MSCs和淋巴细胞共培养体系,检测MSCs对T细胞增殖、周期、活化、凋亡以及Th细胞分化的影响。结果表型分析结果显示AMSCs和BMSCs的表型基本一致。AMSCs和BMSCs都能抑制T细胞的增殖和早期活化,并在调节辅助性T细胞亚群的分化上作用类似。但在MSC对活化后T细胞的凋亡影响方面,BMSCs能够抑制活化T细胞的凋亡,而AMSC没有这种作用。结论 AMSCs和BMSCs对T淋巴细胞的影响基本类似,其对活化T细胞凋亡影响的差异还有待进一步的机制研究。     

两个不同骨髓干细胞亚群体外成肝潜能的比较研究

目的研究与比较骨髓造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)和间充质干细胞(mesen-chymalstemcells,MSCs)肝分化潜能。方法常规法分离培养大鼠骨髓MSCs。以Thy-1.1为标志,免疫磁珠法(magenicactivatedcellsorting,MACS)分离纯化HSCs。探寻MSCs、HSCs的诱导条件,从形态学、RT-PCR和免疫细胞化学法鉴定肝分化结果。结果MACS分选后Thy-1.1 细胞纯度94.20%,细胞活力99.62%。纤维状MSCs诱导后呈圆形,表达白蛋白及其mRNA,不表达甲胎球蛋白。诱导的HSCs为多角形,白蛋白表达逐渐减少,甲胎球蛋白表达逐渐增强。结论MACS方法能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1 干细胞群。MSCs和HSCs二者具有不同的肝系分化潜能。MSCs在HGF/FGF-4的作用下表达成熟肝细胞的特异性基因,分化为成熟肝细胞样细胞;HSCs在HGF/FGF-1/FGF-2的作用下表达早期肝特异性基因,分化为肝干细胞样细胞。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂肪分化能力的研究

探讨不同月龄、去卵巢对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化能力的影响。选用健康3月龄和6月龄Spraque-Dawley(SD)雌性大鼠行双侧卵巢切除术,建立骨质疏松症的动物模型;使用密度梯度离心法分别获取各组骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传至3代,加入成脂肪诱导液进行诱导,油红O染色观察细胞内脂滴;并用RT-PCR法检测成脂肪分化标志物脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达水平。实验分为8组:1)3月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs3control);2)3月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs3ovx);3)6月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs6control);4)6月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs6ovx);5)3月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI3control);6)3月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI3ovx);7)6月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI6control);8)6月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI6ovx)。结果显示:(1)年老组大鼠MSCs成脂肪细胞分化能力大于年幼组大鼠;(2)成脂肪诱导后,成脂肪诱导各组MSCs胞浆内均有脂滴形成,MSCs ADI3ovx和MSCs ADI6ovx明显多于相应对照组。(3)成脂诱导后,与相应的对照组相比,MSCs ADI3ovx和MSCs ADI6ovx LPL mRNA表达水平明显增高。研究结果表明,年老组和去卵巢骨质疏松大鼠(MSCs)向脂肪细胞分化能力皆增强。