结缔组织生长因子在血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞中的表达及意义

目的:动态观察结缔组织生长因子(CTGF)蛋白在血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞表达水平的时相变化,探讨其与肝窦内皮细胞下基底膜形成的关系。方法:采用腹部敷贴法建立血吸虫病肝纤维化模型,HE、Masson染色和透射电镜观察其病理变化;免疫组化技术检测CTGF、Ⅳ型胶原(ColⅣ)和层粘连蛋白(LN)在小鼠肝脏组织中的表达和分布;并应用彩色图像分析仪进行定量分析。结果:与正常对照组比较,模型组鼠肝窦内皮细胞表达CTGF蛋白阳性或强阳性,肝窦壁LN、ColⅣ表达水平增高,且随着肝纤维化的发展,CTGF和LN、ColⅣ表达逐渐增强,肝窦内皮下基底膜逐渐增厚。图像定量分析两组平均吸光度值、平均灰度值和阳性面积比具有统计学差异;CTGF蛋白与LN、ColⅣ水平呈正相关。结论:血吸虫病肝纤维化时小鼠肝窦内皮细胞通过CTGF蛋白表达上调,调控细胞外基质产生,导致ColⅣ、LN分泌增加,参与肝窦内皮下基底膜形成,从而引起肝内微循环障碍。     

四氯化碳诱导肝纤维化早期大鼠肝窦内皮细胞及基底膜形态改变的动态研究

 目的：探讨四氯化碳诱导肝纤维化早期大鼠肝窦毛细血管化的形成过程。方法：清洁级雄性SD大鼠采用随机数字表法随机分为2组：正常对照组（N组,6只）和肝纤维化模型组（M组,32只）。M组大鼠腹腔注射50%四氯化碳蓖麻油混合液, N组大鼠腹腔注射生理盐水,剂量为2 mL/kg,每周2次,共4周。分别于造模第3天、1周、2周和4周处死大鼠,HE染色和Masson染色观察肝脏组织炎症及纤维化的改变,透射电镜观察肝窦内皮细胞（LSECs）窗孔与基底膜（BM）的改变,免疫组织化学检测LSECs表面标志物CD31及基底膜成分IV型胶原（Col IV）和层黏连蛋白（LN）的改变。结果：HE及Masson染色显示四氯化碳造模4周早期肝纤维化已形成。肝组织透射电镜显示四氯化碳造模第3天后开始出现LSECs窗孔直径变小及数目减少,随着造模时间的延长,LSECs失窗孔现象逐步严重,至第4周时局部内皮下可见连续的基底膜。免疫组化染色显示LSECs表面标志物CD31表达随着LSECs窗孔数目的减少而逐渐增强;基底膜成分Col IV于造模第2周时表达开始显著增强并随着造模时间延长表达逐渐增强,LN于造模第4周时表达开始显著增强。结论：肝纤维化早期大鼠局部肝组织可见典型的肝窦毛细血管化形成;肝窦壁内LN沉积是肝窦毛细血管化时形成连续基底膜的关键因素。     

肝窦及窦周隙病变在慢性乙型肝炎肝微循环障碍中担当关键角色

目的 探讨肝窦及窦周隙病变对肝微循环障碍的影响.方法 对200例慢性乙型肝炎(CHB)肝组织用HE、组化、免疫组化及原位杂交技术,就肝窦及窦周隙病变的形态学、体视学及超微结构改变作了观察.结果 其病变有狭窄、阻塞、扩张、窦周隙淤血、肝窦毛细血管化表现.体视学示肝窦数目减少,总面积、总周长、平均直径增加,与对照组差异有显著性(P<0.01),CHB轻与CHB中、CHB重及CHB/LC之间差异也有显著性(P<0.01).电镜观察示窦内皮有撕裂、窗孔减少、窦内皮细胞增生出芽形成血管腔,贮脂细胞转化为肌成纤维细胞,同时伴相关蛋白表达增加.结论 肝窦及窦周隙病变在肝微循环障碍中担当     

羟基红花黄色素A对肝纤维化大鼠血清学指标及脂质过氧化的影响

目的观察羟基红花黄色素A(HYSA)对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化(HF)大鼠血清学指标及脂质过氧化的影响。方法清洁级雄性SD大鼠60只,体重(180±30)g,随机分为A、B、C、D、E组,A组(正常对照组)、B组(HF模型组)、C组(红花组)、D组(HYSA组)、E(秋水仙碱组),除A组外,其余各组采用CCl4灌胃,诱导大鼠肝纤维化模型;造模第2周起,腹腔注射给予相应药物,8w后处死大鼠取血清及肝组织标本,光景下观察肝组织结构变化及肝纤维化程度,放射免疫技术检测测定血清中ALT、AST、ALB含量,分光光度计检测肝组织匀浆中SOD和MDA的含量。结果与B组比较,C、D、E组大鼠血清中ALT、AST活性显著降低,ALB含量显著升高,肝细胞变性、坏死明显减少,肝组织纤维化程度明显减轻,肝组织MDA含量显著降低,SOD活性显著升高;与C组比较,D组的肝纤维化程度显著减轻,两者比较有统计学意义(P<0.05)。结论 HYSA作为红花抗肝纤维化的主要有效作用成分,能够保护肝组织,减轻肝细胞水肿程度,减轻其纤维化程度,并能促进损伤肝组织的修复,且其抗肝纤维化作用机制可能与其抗脂质过氧化作用有关。     

刀豆素蛋白A诱导小鼠肝纤维化模型的建立

目的　建立小鼠的肝纤维化模型。方法　 2 0只Balb c小鼠随机分 2组。实验组 (E组 )小鼠经尾静脉注射12 .5mg kg剂量的 1mol L刀豆素蛋白A(ConA) ,每周 1次 ,连续 6周 ;而对照组 (N组 )正常小鼠则相应地经尾静脉注射 2 5 0 μLPBS。每次注射ConA或PBS 2 4h后 ,经小鼠尾静脉取血检测ALT和AST。第 6次注射ConA一周后处死小鼠 ,取肝组织做HE染色及MassonTrichrome染色 ,显微镜下观察肝脏组织形态改变及胶原沉积情况。结果　与对照组比较 ,实验组小鼠的ALT和AST均明显升高 ,肝体积明显增大 ,表面不光滑 ,布满增生小结节。光镜下见肝组织结构紊乱 ,肝细胞坏死明显 ,有较多的淋巴细胞浸润。MassonTrichrome染色胶原明显增多。结论　反复静脉注射ConA可成功诱导建立小鼠肝纤维化模型。     

白屈菜红碱对肝纤维化小鼠TGF-β/Smads信号通路的影响

目的:探讨白屈菜红碱对四氯化碳(CCl_4)诱导的肝纤维化损伤小鼠的保护作用及对转化生长因子β(TGF-β)/Smads信号通路的影响。方法:50只C57BL/6N小鼠随机分成正常对照组、模型组及白屈菜红碱低剂量(10 mg·kg~(-1)·d~(-1))、中剂量(20 mg·kg~(-1)·d~(-1))和高剂量(40 mg·kg~(-1)·d~(-1))3个剂量组,每组10只。采用腹腔注射CCl_4和橄榄油混合液8周诱导小鼠肝纤维化模型,白屈菜红碱组于第5周开始灌胃给药。第14周后处死小鼠,观察白屈菜红碱各剂量组干预后小鼠的肝指数,苏木精-伊红染色和苦味酸-酸性品红染色法观察小鼠肝组织的病理改变及肝纤维化的程度;采用分光光度计和酶标仪测定血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、透明质酸(HA)和肝组织中羟脯氨酸(Hyp)的含量;RT-q PCR检测TGF-β1、Smad3、Smad4和Smad7的mRNA表达;Western blot检测TGF-β1、Smad4和Smad7的蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型组肝纤维化的病理改变明显,肝指数、AST、ALT、HA和Hyp均显著升高(P0.05);TGF-β1、Smad3和Smad4的mRNA表达显著上调,Smad7的mRNA表达显著下调(P0.05);TGF-β1和Smad4的蛋白表达显著上调,Smad7的蛋白表达显著下调(P0.05);与模型组比较,白屈菜红碱不同剂量给药组均抑制上述指标的改变(P0.05)。结论:白屈菜红碱能够抑制CCl_4诱导的小鼠肝纤维化,其机制可能与TGF-β/Smads信号通路有关。     

TOLL样受体-4和髓样分化蛋白-2在血吸虫病小鼠肝脏的表达及意义

目的:探讨血吸虫病小鼠肝脏TOLL样受体-4(TLR-4)和髓样分化蛋白-2(MD-2)的表达及其在肝脏损害中的作用。方法:将40只健康小鼠随机分成正常对照组(N组,20只)与模型组(M组,20只),M组采用腹部敷贴法制作血吸虫病模型,造模150天后处死动物,鲎试验法测定血清内毒素水平;免疫组化和RT-PCR方法检测肝脏中TLR-4和MD-2的表达。结果:M组血清内毒素水平高于N组(P<0.01);M组小鼠肝脏TLR-4/MD-2表达水平高于N组(P<0.01);M组小鼠肝脏TLR-4/MD-2高表达主要位于肝窦内皮细胞及肝窦区周围细胞。结论:血吸虫病肝硬化可发生肠源性内毒素易位、内毒素血症;脂多糖通过其信号转导蛋白TLR-4和MD-2在肝脏的高表达,激活一系列促炎基因的转录,可能是引起血吸虫病肝脏损害的原因之一。     

血吸虫病肝纤维化中碱性成纤维细胞生长因子的免疫组化研究

目的　研究血吸虫病肝纤维化时碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)在肝脏的表达情况及初步探讨其与纤维化的关系。方法　采用经皮肤感染日本血吸虫尾蚴法建立小鼠血吸虫病肝纤维化模型。利用免疫组化技术研究bFGF在肝纤维化过程中的表达情况 ,并用VG染色显示胶原纤维的沉积情况。结果　小鼠感染后 6周时 ,出现急性血吸虫卵肉芽肿 ,肝内bFGF阳性细胞的分布与对照组无明显差异 ,VG染色显示肉芽肿内无胶原沉积 ;8周时 ,许多bFGF阳性细胞聚集围绕在虫卵肉芽肿周围 ,且细胞形状由原来的多角形变为长梭形。同时 ,VG染色显示肉芽肿周围出现一些胶原纤维 :1 0周时 ,bFGF阳性细胞和胶原纤维均增多。结论　bFGF与血吸虫病肝纤维化有密切关系 ,可能在该病的发生和发展过程中起重要作用     

Hh信号通路因子Shh、Ptch1和Gli1在大黄蛰虫丸抗大鼠肝纤维化中的表达及调节作用

目的探讨大黄蛰虫丸(DZP)对CCl4诱导肝纤维化大鼠肝脏Hedgehog(Hh)信号通路因子Shh、Gli1、Ptch1的影响及其机制。方法选SD雄性大鼠30只,体质量180～200 g,随机分为对照组(N组)、模型组(M组)和灌药组(D组)。后2组行CCl_4诱导肝纤维化造模,8周后D组、C组大鼠分别给予DZP药液灌胃,NG组大鼠给予等量生理盐水。连续灌胃4周后,断头处死各组大鼠,摘取肝脏,应用HE和Masson染色法检测各组别大鼠肝组织纤维化程度;应用Western blot和RT-PCR法分别检测各组大鼠肝组织Hh信号通路因子Shh、Ptch1、Gli1的蛋白及基因表达水平,用Quantity One图像分析软件进行条带光密度分析,计算光密度值(A值)。结果 M组大鼠肝纤维化明显,而D组大鼠肝的纤维化程度显著改善。Hh信号通路因子Shh、Ptch1、Gli1的基因和蛋白表达水平检测结果显示:与N组相比,M组大鼠肝组织中三者的A值均显著上调(P<0.05);而与M组相比,D组大鼠肝组织中三者的A出现显著下调(P<0.05),数据表明大鼠肝纤维化造模成功后,给予DZP干扰,后者可能通过抑制Shh、Gli1、Ptch1的基因和蛋白表达,从而抑制了肝纤维化过程中异常激活的Hh信号通路。结论 DZP可能通过抑制异常激活的Hh信号通路来逆转大鼠肝纤维化。     

TGFβ1，CTGF信号转导通路的变化在实验性小鼠肝纤维发生中的作用

 摘要：目的 探讨实验性肝纤维化小鼠肝组织中TGFβ1,CTGF信号转导通路的变化及意义。方法30只C57BL6/J小鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组,采用10%的CCL4橄榄油腹腔注射诱导小鼠肝纤维化模型,对照组给予生理盐水灌胃,共造模8周。观察血清ALT、HA水平,HE染色、Masson染色观察肝组织炎症及纤维化程度,免疫组化法和RT-PCR法对肝组织α-SMA、TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad3,Smad7,CTGF蛋白和mRNA水平进行检测,并与对照组肝组织进行比较。结果 模型组小鼠血清ALT及HA水平明显高于对照组;模型组小鼠肝组织α-SMA、TGFβ1、TGFβRII、Smad3、CTGF蛋白表达和TGFβ1、Smad3、CTGF mRNA表达明显高于对照组,而模型组肝组织Smad7蛋白和Smad7 mRNA表达较对照组小鼠显著降低。结论 TGFβ1和CTGF信号转导通路过度活化,Smad7表达和负调节TGFβ、CTGF信号转导通路的功能被抑制可能与肝纤维化的发生和发展密切相关。     

肝星状细胞SCAP特异性敲除对小鼠肝纤维化的影响

目的:探讨固醇调节元件结合蛋白裂解活化蛋白(SCAP)在肝星状细胞中缺失能否延缓小鼠肝纤维化进程.方法:将SCAPloxP/loxP小鼠与Lrat-Cre工具鼠繁殖得到Lrat-Cre+/+SCAPfl/fl、Lrat-Cre+/?SCAPfl/fl和Lrat-Cre?/?SCAPfl/fl小鼠,并用PCR法对小鼠基因...     

根皮苷对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的抑制作用

探讨根皮苷对日本血吸虫感染所致小鼠肝纤维化的保护作用。随机将未感染和感染日本血吸虫尾蚴昆明小鼠分成4组A—D,每组10只：未感染空白对照组（A）、模型组（B）、复方鳖甲软肝片阳性组（C）、根皮苷治疗（40mg/（kg·d））组（D）。感染后第42d,B、C、D组均用吡喹酮驱虫治疗500113tg／（kg·d）,2日疗法,之后各组开始灌胃给药持续治疗60d,A和B组生理盐水灌胃对照。实验结束处死小鼠,留取肝脏组织和血清,测定血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、透明质酸（HA）含量,计算肝体指数,测定肝组织中羟脯氨酸（HYP）含量。苏木素-伊红和Masson胶原纤维染色观察小鼠肝组织变性、虫卵肉芽肿与胶原沉积等病理改变。结果显示,与A组相比,B、C、D组小鼠肝脏有明显虫卵肉芽肿形成、胶原沉积与肝纤维化,伴有不同程度肝细胞炎性损伤坏死。血清中ALT、AST、HA和肝组织中HYP含量均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。与B组相比,根皮苷组ALT、AST、HA和HYP含量和肝体指数均明显降低（P〈0．05或P〈0．01）,肝组织坏死与胶原沉积明显减轻,虫卵肉芽肿面积减小。结果表明根皮苷具有抗血吸虫性肝纤维化的作用。     

脂肪肝对小鼠肝血窦内血流状况的影响

目的 由于脂肪肝状态下肝细胞的体积变化可能导致肝内血液流动特征改变,本研究拟通过观测肝内的形态学、血流速度和迂曲度的变化,为脂肪肝的诊治提供帮助。 方法 小鼠背部皮下注射四氯化碳或橄榄油溶液建立脂肪肝模型,取小鼠肝组织进行HE与油红O染色;采用激光多普勒仪测量肝左叶浅表血管内的血流速度;小鼠尾静脉注射德克萨斯红荧光染料,双光子荧光显微镜下观察及测量小鼠肝血窦内红细胞的流动速度及血管内径状况,并进行肝血窦迂曲度检测。 结果 给予小鼠四氯化碳注射2周（n=16）和4周（n=16）后,油红O染色可见肝细胞内出现不同程度的红色脂滴沉积,且主要集中在中央静脉周围,肝血窦存在明显的变形和缩窄,且4周组更加明显。随着模型制作时间的延长,肝左叶的的浅表区域和肝血窦内的血流速度逐渐降低,且肝血窦的内径变小,迂曲度增加。 结论 脂肪肝状态下,肝血窦内径减小,血窦内血流速度下降,迂曲度增加,为脂肪肝早期诊断和治疗提供了可视化的形态学实验依据。     

Amelioration of hepatic fibrosis via beta-glucosylceramide-mediated immune modulation is associated with altered CD8 and NKT lymphocyte distribution

Background: While CD8 lymphocytes possess pro-fibrogenic propertiesand NK (non-T) cells are anti-fibrogenic, the role of NKT lymphocytesin liver fibrosis is still unclear. ß-Glucosylceramide(GC), a naturally occurring glycolipid, exerts modulatory effectson these cells. Aim: To explore the role of NKT cells in hepaticfibrosis via GC. Methods: Hepatic fibrosis was induced by biweeklyintra-peritoneal (IP) carbon tetrachloride (CCl₄) administrationsfor 7 weeks in 5 groups (A–E) of male C57Bl/6 mice. Micewere treated with daily IP GC injections in groups A and C,or daily oral doses in groups B and D. GC was administered eitherfor the duration of the study period (in groups A and B), orfor the last 3 weeks of CCl₄ induction (groups C and D). GC-treatedmice were compared with non-treated fibrotic controls (groupE) and naive rodents (group F). Liver fibrosis, injury parametersand FACS analysis of lymphocytes were assessed. Results: Markedamelioration (P < 0.0001) of hepatic fibrosis observed inall GC-treated mice without altering reactive oxygen speciesproduction. As determined by Sirius red-stained liver tissuesections and measured by Bioquant® morphometry; all CCl₄-administeredgroups significantly (P < 0.0001) increased the relativefibrosis area compared with naive animals. The increases were14.4 ± 1.03-fold in group A, 7.9 ± 0.37-fold ingroup B, 5.2 ± 0.2-fold in group C, 10.3 ± 0.4-foldin group D and 23.8 ± 1.9-fold in group E. Western blotanalysis for alpha smooth muscle actin from liver extracts followeda similar pattern, increasing in groups A–E. A significantdecrease in liver damage was observed in all GC-treated groups,as noted by a decrease in transaminase serum levels (P <0.005). The beneficial effect of GC was associated with a significantdecrease in the intra-hepatic NKT and CD8 lymphocytes as wellas their attenuation of both T_h1 and T_h2 cytokines. Conclusions:Administration of GC had a significant anti-fibrotic effectfollowing CCl₄ administration. This effect was associated withan altered NKT and CD8 lymphocyte distribution and a cytokineshift. Immune modulation using GC may have a role in the treatmentof fibrosis and other immune-mediated disorders.     

肝细胞生长因子和C-met在肝纤维化肝部分切除后残余肝组织中的表达

目的 探讨肝细胞生长因子（HGF）和C-met在纤维化肝部分切除后残余肝组织中的表达变化。方法 雄性SD大鼠130只,随机分为正常组（n=7）、正常肝部分切除组（n=50）、肝纤维化组（n=7）和纤维化肝部分切除组（n=66）。正常肝部分切除组和纤维化肝部分切除组分别在术后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d和14 d 取材,运用免疫组织化学和Western blotting方法,检测残肝组织中HGF、C-met的表达。结果 免疫组织化学显示,正常肝部分切除组,HGF表达于术后12 h达高峰,并维持高峰平台,7 d后逐渐降低,于14 d接近术前水平;C-met术后迅速上升,3 d达到高峰,而后逐步下降,14 d降回术前水平。纤维化肝部分切除组,HGF表达于术后迅速下降,12 h又迅速上升,于1 d时达高峰,然后逐步下降,14 d降至最低点;C-met术后迅速下降,12 h开始缓慢下降,于术后3 d达最低点,后缓慢上升,7 d又迅速上升,14 d达最高点。Western blotting显示,HGF、C-met蛋白条带变化规律与免疫组织化学结果吻合。结论 HGF和C-met同时高水平表达有利于肝细胞的分裂增殖,提示HGF和C-met表达不同步,可能是纤维化肝术后再生困难的重要原因。     

利用CRISPR/Cas-9技术抑制热休克蛋白Gp96的表达对小鼠酒精性肝纤维化的影响

目的 探讨热休克蛋白Gp96对小鼠酒精性肝纤维化的影响。 方法 健康雄性C57BL/6 J小鼠220只,随机分为4组：正常对照组(n=10),生理盐水+酒精诱导纤维化组(n=70)。尾静脉注射CRISPR表达质粒Gp96-sgRNA3+酒精诱导肝纤维化组（n=70）,腹腔注射核因子κB（NF-κB）抑制剂PDTC+酒精诱导肝纤维化组（n=70）。于酒精诱导第8周眼球取血后处死各组小鼠,测定各组小鼠血清谷草转氨酶（AST）活性,HE染色检测各组小鼠肝脏病理变化,天狼猩红染色检测各组小鼠肝纤维化情况,过碘酸-雪夫(PAS)染色检测各组小鼠肝糖原变化情况;免疫印迹法检测小鼠肝脏Gp96和转化生长因子β1(TGF-β1)的表达变化。 结果 与正常对照组相比,其余3组AST酶活性显著上升,肝纤维化加重,糖原显著减少（P<0.01）;与生理盐水+酒精组相比,注射质粒Gp96-sgRNA3+酒精组和注射NF-κB抑制剂+酒精组AST上升更为明显,肝纤维化更严重,糖原减少更多,Gp96表达显著下降,TGF-β1表达显著增加（P<0.01或 P<0.05）。 结论 尾静脉注射CRISPR表达质粒Gp96-sgRNA3显著抑制了小鼠肝脏Gp96的表达,促进了小鼠酒精性肝纤维化程度,NF-κB信号通路对Gp96的表达起到一定的调控作用。