融合基因DNA疫苗STxB-VP1和MDC-VP1对CVB3的免疫效果研究

目的构建融合基因DNA疫苗pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1,并免疫小鼠,观察其免疫效果。方法从痢疾志贺菌PCR扩增志贺毒素B亚单位(STxB)基因片段,用RT-PCR法从小鼠脾细胞扩增巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)基因片段。将这两个基因片段分别与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的衣壳蛋白VP1通过一个编码15肽的柔性接头(Linker)相连接,构建真核表达质粒pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1。120只BALB/c小鼠随机均分为6组,分别在胫骨前肌注射pcDNA3、pcD-NA3/STxB、pcDNA3/MDC、pcDNA3/VP1、pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1,每3周1次,共3次。每次免疫后20d检测血清中中和抗体水平,最后1次免疫后20d用7LD50的CVB3进行致死性攻击,观察小鼠生存率。结果成功构建了融合基因疫苗pcD-NA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1。各组小鼠的生存率分别是10%、10%、15%、40%、20%和75%,中和抗体水平及血中病毒滴度均与生存率一致。结论与pcDNA3/VP1相比,pcDNA3/MDC-VP1可诱导产生高水平的中和抗体,提高小鼠生存率,而pcDNA3/STxB-VP1仅诱导出低水平的中和抗体,小鼠的生存率降低。     

治疗型HBV基因疫苗免疫效果的研究

为探索治疗型HBV基因疫苗治疗慢性乙型肝炎的可行性 ,自行构建了HBV包膜蛋白前S2 ·S基因及人IL 2和IFN γ融合蛋白基因真核表达质粒 ,并将双质粒融合蛋白作为佐剂组合成治疗型HBV基因疫苗 ,在健康小鼠、HBV转基因 (Tg)小鼠、新西兰兔和恒河猴体内进行了免疫效果试验。结果发现 :①特异性CTL活性提高 ;②对HBsAg特异性T细胞增殖能力提高 ,HBsAg 3 0 μg /ml对pcS2 ·S免疫的小鼠脾细胞的刺激指数 (SI =5 6± 0 9)明显较空白质粒pcDNA3 1组 (SI =2 0± 0 5 )为高 (P <0 0 1) ,免疫组的IL 2 /IFN γ分泌水平为 (2 2 6 3± 41 0 5pg/ml) /(5 1 1± 7 7pg/ml) ,明显较空白组的 (69 0± 2 2 1pg/ml) /(0 9± 0 7pg/ml)为高 (P <0 0 1) ;③HBV基因疫苗免疫健康小鼠局部引流淋巴结中DCs的诱导HBsAg致敏T细胞增殖指数 (4 2 0 )较pcDNA3 1组 (2 5 5 )为高 ;⑤用在体电脉冲法注射治疗型HBV基因疫苗后 ,检测血清抗 HBs水平 ,无论是小鼠、兔还是猴均有明显提高。提示该治疗型HBV基因疫苗能较好地诱导体液和细胞免疫 ,为其治疗HBV感染提供了实验依据     

抗大鼠HSP70蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

目的制备大鼠HSP70蛋白单克隆抗体并对其性质进行研究。方法利用PCR技术扩增大鼠全长hsp70,插入表达质粒pET-28a,pMAL-c2x,诱导表达,采用亲和层析纯化融合蛋白;用HIS-HSP70融合蛋白免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备大鼠HSP70单克隆抗体;采用Western印迹和免疫组化方法对抗体性质进行鉴定,ELISA方法确定抗体的表型。结果亲和层析纯化HIS-HSP70蛋白纯度在97.6%,获得6株可稳定分泌抗HSP70mAb的杂交瘤细胞系;抗体的亚类均是IgG1类κ链的。Western印迹结果显示6株单抗均能识别天然的大鼠HSP70蛋白;免疫组化结果显示3株抗体可以识别组织的HSP70蛋白。结论成功获得6株有活性HSP70单克隆抗体,可以识别HSP70蛋白不同表位,为进一步研究HSP70单克隆抗体在疾病中的作用奠定基础。     

基因免疫法制备小鼠抗人肝素酶多克隆抗体

目的:利用基因免疫的方法制备抗人肝素酶抗体.方法:用本室构建的表达肝素酶全长质粒pcDNA3.1(+)-HPA为基因免疫载体,免疫6～8周龄雄性BALB/c小鼠,使得质粒上的目的基因在动物体内表达,诱导动物体对DNA编码的外源蛋白产生抗体而获得肝素酶的抗血清,通过间接ELISA方法测定小鼠抗血清效价,Western 印迹鉴定抗血清特异性.结果:获得了效价较高的小鼠抗血清,最高效价可达到1∶5×104;抗体特异性与标准品一致.结论:建立了一种制备肝素酶抗体的新方法.     

小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

泛素-结核抗原融合基因DNA疫苗诱导的小鼠细胞免疫应答

目的 构建结核杆菌Ag85A抗原DNA疫苗(pA)和泛素基因与Ag85A抗原基因融合的DNA疫苗(pUA),观察疫苗在小鼠中的免疫应答.方法 将构建的DNA疫苗pA和pUA分别肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、IL-4)和细胞毒性T淋巴细胞反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答的强度.结果 pA组小鼠血清IgG水平高于pUA组(P＜0.01),但IgG2a/IgG1比值(4.16±0.20)低于pUA组(7.88±0.30)(P＜0.01).与pA组比较,pUA组小鼠IFN-γ分泌水平增高(P＜0.01),IL-4分泌水平下降(P＜0.01);pUA组的CTL活性高于pA组.结论 融合的DNA疫苗pUA诱生的抗原特异的体液免疫应答不及单基因DNA疫苗pA,但其能诱导更强的细胞免疫应答.提示泛素-Ag85A融合基因DNA疫苗对于防治结核病比单基因DNA疫苗更为有效.     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)自身增强子Ⅰ(enhancerⅠ,ENHⅠ)对HBVDNA疫苗免疫应答的影响。方法采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原(HBsAg)和HBsAg-ENHⅠ基因片段,重组到载体VR1012中,构建两种HBVDNA疫苗,转染COS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB/c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHⅠ的HBVDNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高,两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异;免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHⅠ可使HBVDNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加,对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB/c小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）自身增强子I（enhancerI，ENHI）对HBV DNA疫苗免疫应答的影响。方法 采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原（HBsAg）和HBsA-ENHI基因片段，重组到载体VR1012中，构建两种HBV DNA疫苗，转染CADS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB／c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果 转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHI的HBV DNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高，两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异；免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHI可使HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加，对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB／C小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA 疫苗免疫反应的研究

目的:观察热休克蛋白65的真核表达载体(pHSP65)对HBV DNA疫苗诱导BALB/c小鼠(H-2d)免疫应答的调节作用。方法:肌内注射空载体pcDNA3,HBV DNA疫苗加HSP65佐剂(pHBVS2S pHSP65)或不加佐剂(pHBVS2S);ELISA法测定血清抗HBs抗体;ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性。结果:HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组,但无显著性差异;其IgG1/IgG2 a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.395与10。佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2~3倍。CTLs细胞杀伤活性(E∶T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:(53.68±7.5)%、(42.81±7.7)%,差异显著(P<0.05)。结论:HBV DNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应;HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。     

HBV DNA疫苗诱导健康及HBV转基因小鼠细胞免疫应答

采用HBVCTL表位多肽体外刺激或冲击免疫效 (E)、靶(T)细胞 ,以观察DNA疫苗诱导健康及HBV转基因 (Tg)小鼠细胞免疫效果。结果发现 ,DNA疫苗能有效诱导健康BALB/c小鼠CTL活性 ,活性强弱与E/T比值及其上清液中IFN γ分泌水平有一定关系。HBsAg表位多肽(pp2 0 )体外刺激DNA疫苗免疫组效应细胞 ,培养上清IL 1 2释放水平 (2 1 1 3± 39 8pg/ml)明显较对照组 (86 7±2 7 1 pg/ml)高(P <0 0 5 ,t=4 4 82 )。DNA疫苗免疫HBVTg小鼠诱导CTL活性 (1 2 7%± 6 7% )较蛋白疫苗免疫对照组(1 7%±3 2 % )高(P <0 0 1 ,t=3 6 2 9) ;其效应细胞体外受 pp2 0刺激后分泌IL 1 2水平 (4 0 0± 30 1pg/ml)明显高于同期空载体免疫对照组 (3 8±3 0 pg/ml,P <0 0 5 ,t=2 376 )。采用在体电脉冲法DNA疫苗接种的 5只HBVTg小鼠中 ,于 4周时有 2只血清HBsAg阴转 ,并于 8周时出现抗 HBs阳性 ,而对照组中无一例血清HBsAg发生变化。表明HBVDNA疫苗能有效诱导健康及HBVTg小鼠细胞免疫应答 ,提示其通过增强细胞免疫功能作为抗HBV免疫治疗的可行性     

东部马脑炎病毒E2基因的表达及DNA免疫的初步研究

目的：构建东部马脑炎病毒E2基因的重组真核表达载体，对其DNA免疫原性进行观察。方法：采用RT-PCR扩增东部马脑炎病毒全长E2基因，构建真核表达载体pcDNA-E2，以脂质体法转染COS7细胞，经蛋白印迹法和免疫荧光法证明E2基因可以表达后，用庐重组质粒DNA免疫Balb/c小鼠，并用免疫荧光法检测鼠血清中病毒的特异抗体。结果：免疫印迹法、免疫荧光法检测表明E2基因在COS7细胞中获得瞬时表达，pcDNA-E2基因免疫小鼠可产生抗东部脑炎病毒的特异抗体。结论：东部马脑炎病毒E2基因的重组质粒DNA可刺激小鼠产生特异性的抗东部马脑炎病毒体液免疫应答，为基因疫苗的研制奠定了基础。     

人血管生成素-1基因的克隆及原核、真核表达载体的构建

血管生成素（angiopoietin）是近年来发现的与血管生成、抑制密切相关的分子。为研究其在肿瘤血管生成及转移中的作用，利用PCR技术从人胎盘组织中得到血管生成素-1基因，并亚克隆至pRSET C原核表达载体及pcDNA3.1-V5-HisC真核表达载体，成功地构建了原核及正反义真核表达载体，为下一步研究其对消化道肿瘤血管生成的影响打下了基础。     

血管内皮生长因子转基因治疗小鼠辐射损伤的实验研究

目的 通过构建血管内皮生长因子(VEGF)基因的真核表达质粒,并将其转入受照小鼠机体,研究VEGF蛋白表达对放射损伤的救治作用及其分子机制。方法 昆明种小鼠通过随机化分组表法随机分为正常对照组、单纯照射组和转基因组。转基因组应用VEGF重组质粒进行肌肉注射,注射后24 h接受8 Gy X射线照射,进行小鼠临床表现和死亡率观察。并于照后不同时间处死动物,进行组织器官病理学和原位胸腺和脾细胞凋亡检测。结果 用PCR方法从pSP73/H_VEGF165质粒扩增得到VEGF₁₆₅基因片段,经双酶切后与酶切的pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/ VEGF₁₆₅,经电泳和测序表明序列与GeneBank完全一致。X射线8 Gy照射小鼠,单纯照射组14 d内死亡率为64%,而转基因组为36%,两组比较差异有统计学意义(t=3.92,P＜0.05)。转基因组小鼠胸腺和脾组织的细胞凋亡率显著降低(t=3.11、3.53,P＜0.05),放射病理损伤明显改善。结论 成功构建了重组质粒pcDNA3.1/ VEGF₁₆₅,重组质粒转基因治疗可显著降低严重辐射损伤小鼠的死亡率,显著减低胸腺和脾脏细胞凋亡率,明显改善免疫器官的病理变化。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

感觉神经元特异性受体rMrgE基因的克隆与表达

目的 克隆感觉神经元特异性受体rMrgE基因并于HEK293细胞中表达.方法 利用聚合酶链式反应技术,从大鼠背根神经节总RNA中扩增出目的基因rMrgE,克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisB中,构建真核表达rMrgE载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株.采用RT-PCR、免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定.结果 与结论含有rMrgE基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上.本研究为进一步探究rMrgE受体的功能奠定了基础.     

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因,将其插入原核表达载体pET28(a)载体中,构建pET28(a)-HCVE2,从pET28(a)-HCVE2上获得His-HCVE2融合基因,插入pcDNA3．1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3．1-His-E2。用脂质体介导法将pcDNA3．1-His-E2转染CHO细胞,通过间接免疫荧光、Western blot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内声融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法 将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,按正向、反向克隆人真核表达载体pcDNA3．1（＋）。测序正确的重组子pcDNA3．1-a（含GCRG213正向克隆）、pcDNA3．1-b（含GCRG213反向克隆）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,采用半定量RT-PCR及Western blot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin VFITC／PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。与对应的空载体比较,转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35．4%,蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32．1％,蛋白的表达下调50．3％。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快,凋亡率下降,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢,凋亡率增加。结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞凋亡,可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。     

慢性髓系白血病bcr—abl融合基因在真核细胞中的表达

克隆慢性髓系白血病（CML）融合基因bcr-abl融合位点周围的cDNA序列,构建重组真核表达载体并表达于p815细胞,探索bcr-abl基因免疫治疗CML的可行性,设计两条引物扩增bcr-abl融合位点周围468bp的cDNA,测序正确后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1通过电穿法转染至p815细胞中,应用G418筛选阳性细胞克隆,在含10％FCS的RPMI1640中常规培养,收集细胞进行RT－PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr-abl融合基因位点周围的468bp的cDNA,序列测定除第448位碱基C突变为T外其余序列均正确,构建了重组真核表达载体,并用电穿孔法将其转染p815细胞,RT－PCR法检测到该细胞系有bcr-ablmRNA水平的表达。     

MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株的建立及鉴定

为研究胃癌细胞耐药相关新基因MGr1 Ag对胃癌耐药细胞多药耐药性的调节作用及其机制。克隆MGr1 Ag的全长cDNA并构建其正反义真核表达载体 ,以脂质体介导法将正、反义真核表达载体分别转染入人胃癌细胞系MGC80 3与人胃癌多药耐药细胞系SGC790 1/VCR中。结果显示 ,经RT PCR扩增出大小约为 1.0kb的基因片段 ,成功克隆入pUCm T载体 ,经DNA测序证实为MGr1 Ag基因。将其克隆入pCDNA3 .1/V5 His后 ,经限制性核酸内切酶酶切鉴定 ,获得携有MGr1 Ag基因真核表达载体pCD NA3 1/V5 His MGr1 Ag及其反义表达载体pCDNA3 .1/V5 His anMGr1 Ag。以脂质体介导法将MGr1 Ag的正、反义真核表达载体分别转染入MGC80 3与SGC790 1/VCR中 ,经Westernblot证实 ,成功建立了MGr1 Ag表达上调及下调的胃癌细胞株 ,为研究MGr1 Ag参与耐药的分子机制奠定了基础