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HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定 总被引：16，自引：0，他引：16
非结构蛋白ＮＳ5Ａ是丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)编码的一种蛋白分子。我们利用重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ5Ａ为包被抗原 ,从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的ＨＣＶＮＳ5Ａ人源单链噬菌体抗体 ,并对其进行了ＤＮＡ序列测定。本研究所用的ＨＣＶＮＳ5Ａ抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白 ,以聚丙烯酰胺凝胶电泳 (ＰＡＧＥ)证实纯度在95 %以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3 连接的半合成抗体文库。Ｍ13Ｋ0 7购于Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ,ＤＮＡ质粒提取纯化试剂盒购于Ｗｉｚａｒｄ公司。其… 相似文献
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HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定 总被引：22，自引：0，他引：22
目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体（ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCVNS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定,结果 筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗本ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达。 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白4A人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 总被引：4，自引：3，他引：4
目的 利用噬菌体表面展示技术,从半合成人源化单链可变区抗体库中筛选、鉴定丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构蛋白ＮＳ４Ａ的单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）及其编码基因,为抗ＨＣＶ的细胞内免疫基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表达展示技术,以重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ４Ａ为包被抗原,从噬菌单链可变区抗体库中经过３轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的ＨＣＶ ＮＳ４Ａ人单链可变区抗体段阳性克隆 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 总被引：11，自引：0，他引：11
目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 NS3的人单链可变区抗体 (Sc Fv) ,以解决人体内应用鼠单抗时的免疫原性问题 ,为进行抗 HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的 HCV非结构蛋白 NS3为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的 HCVNS3人单链可变区抗体的阳性克隆 ,并对其进行免疫检测及序列测定。结果筛选出来的 Sc Fv片段具有抗 NS3的特异性。证实利用噬菌体抗体库技术 ,可以成功地获得 HCV NS3人单链抗体 Sc Fv的编码基因。结论筛选获得了 HCV非结构蛋白 NS3的特异性单链抗体的编码基因。 相似文献
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目的建立HCV非结构蛋白NS5A基因在斑马鱼肝脏特异表达的模型,研究HCVNS5A的体内作用机制并初步探讨HCVNS5A对肝病理标志基因表达的影响。方法克隆肝基因表达调控序列——斑马鱼脂肪酸结合蛋白基因增强子序列（eFABP）和HCV非结构蛋白基因NS5A序列,利用CMV启动子序列,构建HCVNS5A基因和报告基因绿色荧光蛋白基因eGFP在肝脏共表达的基因构件pFC-5AiR。经细胞转染实验验证所建构件的报告基因DsRed表达红色荧光蛋白后,将该基因构件线性化并经显微注射导入斑马鱼胚胎;通过荧光显微镜观察和整体原位杂交技术对目的基因NS5A的表达进行定位,验证其肝脏特异性表达。采用RT-PCR方法和westernblot方法对HCVNS5A基因的转录和翻译水平进行检测;并检测肝脏病理相关的标志基因的转录水平变化。结果细胞转染实验证明基因构件pFC一5AiR的报告基因DsRed能够在肝癌细胞Huh7中表达;斑马鱼胚胎注射该基因构件后在肝脏能够观察到红色荧光蛋白基因DsRed的表达;RT-PCR和westemblot结果显示HCV基因NS5A能够在斑马鱼体内正确表达;原位杂交结果进一步证明了NS5A的表达集中在斑马鱼肝脏内。进一步RT-PCR检测表明HCVNS5A在斑马鱼体内的表达可导致一些肝代谢和纤维化相关基因的上调,如Adiponectin、LDLR、Argsyn、TGF-β和HMGR等,推测NS5A在肝脏脂肪病变和纤维化中具有一定作用。结论成功建立了斑马鱼肝脏表达HCVNS5A的模型;初步数据表明HCVNS5A在斑马鱼体内的表达与部分肝代谢和纤维化标志基因的异常表达相关;该模型可以用于HCVNS5A的体内病理机制的研究。 相似文献
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人源性抗NS5B单链抗体的制备及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
目的:运用核糖体展示技术制备抗HCV NS5B人源性单链抗体,并进行初步分析。方法:以HCV阳性患者的外周血单个核细胞为材料,扩增全套重链可变区和轻链可变区的基因,构建人单链抗体(scFv)核糖体展示文库;以NS5B蛋白为靶标筛选到scFv基因,并将其连接到pET16b载体并转化至大肠杆菌BL21,诱导表达scFv;对scFv基因测序和特异性分析。结果:成功构建抗HCV scFv库;获得2个具有较强结合活性的scFv;基因分析证实获得预期抗体。结论:成功制备了人源性抗NS5B scFv,为HCV的免疫治疗奠定了基础。 相似文献
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目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础. 相似文献
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目的人源化抗人纤维蛋白单链抗体的重链,降低人抗鼠抗体反应。方法从基因文库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链（ＶＨ－８Ｅ５）同源性７１．８％的人源免疫球蛋白ＨＵＭＨＣＨ１０９重链（ＶＨ）序列,作为人源化改造ＶＨ－８Ｅ５的框架。人工合成人源化ＶＨ－８Ｅ５片段,用连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５,构建表达载体ｐＯＰＥ１０１－ＶＨ－８Ｅ５。转化ＪＭ１０９后用异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导表达。结果经聚丙烯酰胺电泳和ＥＬＩＳＡ证明表达产物相对分子质量３０×１０３左右,有特异性识别和结合人纤维蛋白能力,是亲本抗体ＳｃＦｖ－８Ｅ５活性的４／５左右。人源化ＳｃＦｖ－８Ｅ５表达产量为转化菌总蛋白的１１．２％。结论人源化ＶＨ－８Ｅ５仍具有特异性识别人纤维蛋白的活性,ＳｃＦｖ－８Ｅ５重链的人源化基本获得成功 相似文献
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目的:本研究旨在已构建的大容量人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的基础上,筛选出高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并对抗体基本特性进行初步鉴定。方法:以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标,经过4轮淘洗,筛选出高亲和力的特异性抗乳腺癌scFv,并对其结构序列进行分析;通过ELISA和Western blot方法,鉴定scFv的亲和力和特异性,以及其蛋白的基本表达情况。结果:成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库,获得scFv的长度约为750 bp,ELISA证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性,IPTG诱导表达及Western blot结果显示,scFv为相对分子质量(Mr)30 000的可溶性蛋白。结论:本研究在已构建的大容量抗乳腺癌单链抗体库的基础上,筛选获得了高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库。研究结果为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础。 相似文献
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人源性抗HBs可变区单链抗体基因的构建及核酸序列测定 总被引：6，自引：0，他引：6
将通过噬菌体显示技术获得的一株人源性抗HBs Fab抗体基因重链和k轻链的可变区用编码柔性肽的Linker使其连接成单链,克隆入中间载体,并进行核酸序列测定,为其后的表达及双功能抗体的构建打下基础。 相似文献
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