噬菌体肽库的免疫学应用研究

噬菌体展示肽库技术是一种用于筛选蛋白、多肽的强有力的生物技术,将外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性.本文总结了这一技术及其相关展示系统在蛋白质相互作用的研究、抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点.     

表面展示技术研究进展

表面展示技术（ｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｔｅｃｈｎｌｏｇｅ）是近年来发展起来的一种将外源肽或蛋白质与噬菌体或细菌表面特定量融合并展示于其表面，构建蛋白质或多肽文库，并从中筛选所感兴趣的特异性蛋白质，多肽或抗体的基因工程高新技术，这一技术在抗体的制备，蛋白质间相互作用的研究，活菌苗和生物催化剂发展等方面有其广泛的应用潜力和独特的优点。     

基于抗原表位制备抗人GP73单克隆抗体

目的:制备抗GP73蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:将GP73蛋白N末端的肽段(AAAERGAVELK)展示于T7噬菌体表面,扩增重组噬菌体作为抗原免疫小鼠,制备抗体。通过ELISA法检测小鼠血清抗体的效价,筛选分泌抗GP73蛋白抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Westernblot等方法检测mAb的特异性。结果:利用表面展示GP73抗原表位的重组噬菌体为抗原免疫小鼠,通过细胞融合和筛选得到了能识别GP73蛋白的mAb,且特异性较好。结论:将蛋白质抗原的合适抗原表位展示在T7噬菌体表面,用这种重组噬菌体作为替代抗原可以制备识别全蛋白的mAb。     

噬菌体表面展示技术进展

噬菌体表面展示技术 (PhageDisplayTechniques ,PDT)是近年发展起来的 ,将外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术。可用来构建肽文库、抗体库 ,并从中筛选出有价值的活性肽或蛋白。随着该技术的不断发展和完善 ,已在许多领域得到了广泛应用     

083噬菌体表面展示技术进展

噬菌体表面展示技术(Phage Display Techniques,PDT)是近年发展起来的,将外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术.可用来构建肽文库、抗体库,并从中筛选出有价值的活性肽或蛋白.随着该技术的不断发展和完善,已在许多领域得到了广泛应用.     

噬菌体表面展示技术进展

噬菌体表面展示技术(Phage Display Techniques,PDT)是近年发展起来的,将外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术。可用来构建肽文库、抗体库,并从中筛选出有价值的活性肽或蛋白。随着该技术的不断发展和完善,已在许多领域得到了广泛应用。     

丝状噬菌体表面呈现技术

对丝状噬菌体的结构、基因组及生命周期的深入认识,是丝状噬菌体表面呈现技术建立和发展的基础。可将外源基因片段插入噬菌体的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先导序列的紧下游,使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面外壳蛋白gp3或gp8的N端,这样的呈现常能使表达的多肽保持生物活性,据此可用活的噬菌体直接方便、高效率地筛选目的基因或检测该基因产物的活性。这技术已被用于抗体基因文库、cDNA文库、随机多肽基因文库和突变基因文库的构建和筛选等方面。     

噬菌体展示抗体库技术的研究进展及临床应用

治疗性抗体的发展,主要经历了异源性抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前,人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向,而噬菌体抗体库构建技术为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台。噬菌体展示抗体库构建技术,是一种将抗体组合文库与噬菌体表面展示技术相结合所形成的新技术,是20世纪90年代初期抗体工程领域的一项重大进展,目前广泛应用于生物医学的多个方面。将就此技术的原理、分类、筛选方法及主要应用领域等方面进行综述。     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体（ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCVNS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定,结果 筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗本ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

噬菌体展示技术在全人源性抗体发现中的应用北大核心CSCD

噬菌体展示技术是目前应用最广泛的体外抗体筛选技术，它以噬菌体为载体，将外源抗体库基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中，在噬菌体表面表达衣壳蛋白的同时也展示了抗体分子。抗体药物因靶向优势在肿瘤免疫和病原生物感染中都发挥着重要作用，是其成为医药研发领域热点的重要推动力。因此，本文对噬菌体展示技术的研发背景、基本原理、抗体库构建类型及抗体展示片段类型进行综述，并对基于噬菌体展示的全人源性抗体的最新进展和应用前景进行了展望。     

抗端粒酶蛋白hTERT重链可变区基因的克隆和表达

利用噬菌体表面展示技术制备端粒酶蛋白hTERT抗体，从重组的hTERT免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA，以逆转录合成的cDNA第一条链为模板，用VHback和VHfor引物，通过PCR扩增出约350bp大小的抗hTERT重链可变区基因，将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB 5E中，转化入E.coli TG1宿主菌后，在M13K07辅助噬菌体帮助下，将VH与g3蛋白形成的复合物展示于噬菌体表面，我们利用Dot Blot检测方法筛选出hTERT具有亲和性的VH单功能区抗体，结果提示噬菌体展示技术是制备抗体的一种有效的新途径。抗hTERT VH基因克隆成功，为进一步构建单链抗体SvFv奠定了基础。     

噬菌体抗体库筛选技术研究进展

噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体(scFv)的噬菌体。用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来, 组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体, 即为噬菌体抗体库 [1]。经特定抗原或细胞筛选后, 便可获得特异性抗体。噬菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤 [2, 3]。1　噬菌体呈现人抗体库的基本原理噬菌体抗体在膜表面表达, 是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成。其特点是“它既可识别相应的抗原并与其结合, 又能够感染宿主菌进行再扩增”。利用其可再扩增的特性, 以靶抗原通过亲…     

表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽(PAP_(114-128))的PP7噬菌体样颗粒的制备及其活性验证北大核心CSCD

目的获得表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽片段(PAP_(114-128))的PP7噬菌体样颗粒,并证实其保留原有的生物活性。方法用基因突变和重叠PCR技术扩增出PP7衣壳蛋白单链二聚体(简称为2PP7)基因,将其插入到载体p ETDuet-1中,获得质粒p ETDuet-2PP7,然后通过普通PCR获得携带有PAP_(114-128)编码基因的PP7衣壳蛋白基因,将其插入到质粒p ETDuet-2PP7中,获得质粒p ETDuet-2PP7-PAP_(114-128);将上述重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达产物用SDS-PAGE、双向免疫扩散以及ELISA进行鉴定。结果以ExTaq DNA聚合酶行重叠PCR可获得2PP7基因,其表达产物衣壳蛋白单链二聚体与野生型PP7噬菌体衣壳蛋白的抗原性相同;展示于PP7噬菌体样颗粒表面的PAP_(114-128)表位与天然的人PAP蛋白相应表位无异,且能诱导较高水平的抗体产生。结论含重复序列的2PP7基因可通过将基因突变和重叠PCR技术联用获得,且以其为基础成功制备表面展示有PAP114-128的PP7噬菌体样颗粒,不仅可解决多肽不稳定的问题,也为研究多肽的递送及功能奠定基础。     

突变肽库的构建及其应用--噬菌体展示短肽的改造

1990年, 由Parmley和Smith[1]提出并建立的噬菌体展示技术(phagedisplaytechnique, PDT)是以噬菌体或噬菌粒为载体, 表达蛋白、单链抗体、酶及短肽。由此衍生的多种噬菌体展示库, 可用于研究蛋白质之间或蛋白与非蛋白之间相互作用, 如抗原与抗体的相互作用。然而, 在对噬菌     

表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽(PAP_(114-128))的PP7噬菌体样颗粒的制备及其活性验证

目的获得表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽片段(PAP_(114-128))的PP7噬菌体样颗粒,并证实其保留原有的生物活性。方法用基因突变和重叠PCR技术扩增出PP7衣壳蛋白单链二聚体(简称为2PP7)基因,将其插入到载体p ETDuet-1中,获得质粒p ETDuet-2PP7,然后通过普通PCR获得携带有PAP_(114-128)编码基因的PP7衣壳蛋白基因,将其插入到质粒p ETDuet-2PP7中,获得质粒p ETDuet-2PP7-PAP_(114-128);将上述重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达产物用SDS-PAGE、双向免疫扩散以及ELISA进行鉴定。结果以ExTaq DNA聚合酶行重叠PCR可获得2PP7基因,其表达产物衣壳蛋白单链二聚体与野生型PP7噬菌体衣壳蛋白的抗原性相同;展示于PP7噬菌体样颗粒表面的PAP_(114-128)表位与天然的人PAP蛋白相应表位无异,且能诱导较高水平的抗体产生。结论含重复序列的2PP7基因可通过将基因突变和重叠PCR技术联用获得,且以其为基础成功制备表面展示有PAP114-128的PP7噬菌体样颗粒,不仅可解决多肽不稳定的问题,也为研究多肽的递送及功能奠定基础。     

核糖体展示技术的原理与应用

通过构建分子文库 (ｃＤＮＡ文库、随机肽库、抗体库及其它蛋白文库 ) ,采用合适的筛选技术可以非常方便、有效、快速地筛选生物活性物质。目前分子文库技术已经广泛应用于抗原表位分析、功能小肽分子 (如肽类拮抗剂和激动剂 )或功能蛋白分子 (如抗体 )的筛选和改造等领域。筛选技术主要有两类 :1.体内筛选技术 ,如噬菌体展示技术〔1〕 、选择性感染噬菌体技术〔2〕 等。 2 .体外筛选技术 ,如核糖体展示技术〔3〕。噬菌体展示技术是应用最为广泛的一种筛选技术 ,但其自身无法克服的缺点给具体应用造成了许多障碍。以噬菌体抗体库为例 ,由于…     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库(surface display phage antibody library)技术用PCR扩增出抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面表达技术(surface display),把Fab段或单链抗体(single chain Fv,ScFv)表达在噬菌体表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。这一技术将表型和基因型联系在一起,使识别抗原的能力和进行再扩增的能力结合在一起,是一极为高效的表达、筛 选体系,使单抗的制备根本改观,在生物技术领域极具潜能。     

噬菌体展示系统的研究进展

噬菌体展示是一种用于筛选和改造功能性多肽/蛋白质强有力的生物技术,广泛应用在蛋白组学,未知基因的克隆和测序等多个分子生物学领域。展示技术使用的噬菌体系统有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。丝状噬菌体pⅢ系统单价展示,可以筛选高亲和力配体,pⅧ系统拷贝数高,利于疫苗的研制,但丝状噬菌体分泌释放,不易展示大分子蛋白;λ噬菌体和T4噬菌体系统容量大,拷贝数高,但不易筛选高亲和力配体;T7噬菌体系统可以高、中、低拷贝展示不同分子量的蛋白,是目前最为理想的展示系统。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 NS3的人单链可变区抗体 (Sc Fv) ,以解决人体内应用鼠单抗时的免疫原性问题 ,为进行抗 HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的 HCV非结构蛋白 NS3为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的 HCVNS3人单链可变区抗体的阳性克隆 ,并对其进行免疫检测及序列测定。结果筛选出来的 Sc Fv片段具有抗 NS3的特异性。证实利用噬菌体抗体库技术 ,可以成功地获得 HCV NS3人单链抗体 Sc Fv的编码基因。结论筛选获得了 HCV非结构蛋白 NS3的特异性单链抗体的编码基因。     

噬菌体文库与计算机模拟筛选H1N1 流感病毒血凝素结合位点的比较

目的:对H1N1 流感病毒血凝素HA 的抗原表位初步筛选。方法:用噬菌体展示文库对2 株抗体的结合位点进行筛选,将筛选的抗原位点结合HA 序列进行多肽合成,免疫小鼠制备单克隆抗体,通过分子生物学手段对4 株抗体的轻链和重链可变区基因进行调取,通过计算机模拟抗体序列结合的抗原的结构域,推测抗体结合的氨基酸位点。结果:噬菌体文库筛选得出抗体的结合序列富含组氨酸和精氨酸,将针对多肽的单克隆抗体的序列和前期获得的2 株抗HA 单克隆抗体的序列比对分析,发现A1-8 和anti-14p 结合的HA 抗原序列相一致,H1-13 和anti-11p 结合的HA 抗原序列相一致。结论:通过将噬菌体展示文库技术和计算机模拟预测抗原抗体结合,可以有效筛选抗原表位,为流感病毒HA 抗原表位预测方法的完善提供理论基础。