PYK2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响.方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定.用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况.结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组.结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用.     

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响研究

目的 应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及P53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法 分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H2O2刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用Real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-8实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果 饥饿与H2O2刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,Real-time PCR及Western Blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时P53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR 等表达量下降。结论 Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H2O2刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。     

辛伐他汀对大鼠心脏成纤维细胞增殖的抑制作用

目的探讨辛伐他汀(simvastatin,Sim)对大鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖的抑制作用,为防治高血压心肌纤维化提供理论依据。方法以培养的新生SD大鼠CFs为实验模型,采用四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞数目,流式细胞分析技术(FCM)检测细胞周期,分别观察不同浓度Sim对AVP诱导CFs增殖的作用。结果(1)随着Sim浓度的增高,CFsMTT比色法D490值呈明显的递减趋势,其中1×10-6 和1×10-5 mol/LSim组的D490值分别为0.215±0.041和0.163±0.018,均较对照组D490值(0.393±0.048)显著降低(P<0.01);(2)FCM细胞周期分析表明,CFs的S期细胞百分率和细胞增殖指数随Sim刺激浓度的增加而呈递减趋势,G0/G1期细胞百分率呈递增趋势,其中1×10-6 和1×10-5 mol/LSim组与对照组1×10-7 mol/LAVP比较,差异显著(P<0.01)。结论Sim可抑制AVP诱导的CFs增殖,其作用可能与影响CFs细胞周期有关。     

川芎嗪对心脏成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的观察川芎嗪（TMP）对体外培养心脏成纤维细胞（CF）的增殖与胶原合成的影响。方法用消化法培养新生SD大鼠的CF，用四氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞增殖，羟脯氨酸碱水解法测定胶原合成．观察不同浓度TMP对CF增殖和胶原合成的影响。结果随着TMP浓度的升高，MTT比色法A490值呈下降趋势；CF分泌的胶原随着TMP作用浓度和时间的增加呈递降趋势。结论TMP具有抑制SD新生大鼠CF增殖和胶原合成的作用。     

EGF对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响

目的观察EGF对大鼠真皮成纤维细胞增殖活性的影响.方法将传代培养的第3代大鼠真皮成纤维细胞(FB)以含有新生牛血清的DMEM培养基进行培养,当细胞培养至对数生长期时,分别改用添加有不同浓度EGF的培养液继续培养,以MTT法测定细胞增殖活性.结果在培养液中添加不同浓度的EGF,FB的增殖活性均有不同程度的增加.结论EGF对体外培养大鼠真皮成纤维细胞的增殖具有促进作用.     

EGF对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响

目的观察EGF对大鼠真皮成纤维细胞增殖活性的影响。方法将传代培养的第3代大鼠真皮成纤维细胞(FB)以含有新生牛血清的DMEM培养基进行培养,当细胞培养至对数生长期时,分别改用添加有不同浓度EGF的培养液继续培养,以MTT法测定细胞增殖活性。结果在培养液中添加不同浓度的EGF,FB的增殖活性均有不同程度的增加。结论EGF对体外培养大鼠真皮成纤维细胞的增殖具有促进作用。     

溶血磷脂酸对心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的：观察溶血磷脂酸（LPA）对体外培养心脏成纤维细胞（CF）的细胞增殖和胶原合成的影响。方法：用消化法培养新生SD大鼠的CF，实验分为四组。对照组（加含5％小牛血清的DMEM培养液），实验组根据不同浓度的LPA又分为10^-6μmol／L组、10^-7μmol／L组和10^-8μmol／L组。用单四唑（MTT）比色法测定细胞增殖，羟脯氨酸碱水解法测定胶原合成，分别观察不同浓度LPA对CF增殖和胶原合成的影响。结果：①随着LPA浓度的升高，MTT比色法吸光度（A490）值呈上升趋势。在药物作用48h后，仅有10^-6μmol／L组A。值较对照组有显著升高（P〈0．05）；作用至72h后，10^-8μmol／L组、10^-7μmol／L组、10^-6μmol／L组A490值均较对照组显著升高（P〈0．05）；作用至96h后，各实验组A。值较对照组均有显著升高（P〈0．05和P〈0．01）。②随着LPA浓度和作用时间的增加，CF分泌的胶原呈递增趋势。LPA作用48h仅10^-6μmol／L组胶原浓度较对照组显著升高（P〈0．01）；作用至72h后，10^-7μmol／L组、10^-8μmol／L组胶原含量较对照组有显著升高（P〈0．05和P〈0．01）；作用至96h，各实验组胶原含量均较对照组有显著升高，10^-6μmol／L组与10^-7μmol／L组、10^-8μmol／L组之间差异亦有显著性意义（P〈0．05）。结论：LPA具有促进SD新生大鼠CF增殖和胶原合成的作用。     

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及p53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H₂O₂刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-1实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果饥饿与H₂O₂刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,real-time PCR及Western blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时p53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR等表达量下降。结论Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H₂O₂刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。     

辛伐他汀对血管升压素诱导大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的　探讨辛伐他汀 (Simvastatin ,Sim)对血管升压素 (AVP)诱导的新生SD大鼠心脏成纤维细胞 (CFs)增殖的影响 ,为防治高血压心肌纤维化提供理论依据。方法　采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生SD大鼠CFs,以3H 胸腺嘧啶核苷 (3H TdR)掺入法测定DNA合成、四氮唑盐 (MTT)比色法测定细胞数目 ,分别观察不同浓度Sim对AVP诱导CFs增殖的作用及甲羟戊酸 (Meval onate,MVA)干预的影响。结果　①CFs(2 0 0个细胞 )的3H TdR掺入率随着Sim干预浓度的增加而降低 ,其中 1 0 - 6mol/LSim和 1 0 - 5mol/LSim组的3H TdR掺入率分别为 (1 1 75± 2 0 2 6 6 )、(771± 1 6 4 86 )cpm ,明显低于对照组 (1 95 5± 3 72 45 )cpm(P <0 0 1 ) ;②MTT比色法A490 值随Sim浓度的增加而降低 ,其中 1 0 - 6、1 0 - 5mol/LSim组的A490 值分别为 0 2 1 5± 0 0 4 1和 0 1 6 3± 0 0 1 8,均较对照组A490值 0 3 93± 0 0 4 8显著降低 (P <0 0 1 ) ;③ 1 0 - 5mol/LSim +1 0 - 3mol/LMVA组的3H TdR掺入率、MTT比色法A490 值分别为 (1 995±3 5 3 83 )cpm和 0 41 8± 0 0 4 5 ,均显著高于 1 0 - 5mol/LSim组 (P <0 0 1 )。结论　辛伐他汀可抑制AVP诱导的CFsDNA的合成和细胞数目增加 ,提示Sim可抑制CFs增殖 ,其机制可能通过甲     

靶向沉默SIRT1对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

目的 探究沉默信息调节因子1(SIRT1)对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响作用.方法 应用转化生长因子-β1处理乳鼠原代心肌成纤维细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测SIRT1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达水平;Western blot法检测SIRT1、α-SMA的蛋白表达水平;MTT法检测心肌成纤维细胞的细胞增殖活性;使用LipofectamineTM 2000 Reagent向乳鼠原代心肌成纤维细胞中转染siRNA-SIRT1.结果 转染siRNA-SIRT1的心肌成纤维细胞,SIRT1蛋白和mRNA 表达下降,同时α-SMA蛋白和mRNA表达下降;转染siRNA-SIRT1明显抑制心肌成纤维细胞的增殖活性.结论 siRNA-SIRT1对心肌成纤维细胞增殖活性有明显抑制作用,SIRT1可能成为心脏结构重构防治的新靶点,其调控剂的应用将为心肌纤维化的防治提供新的思路和方案.     

苦参碱抑制大鼠肺成纤维细胞增殖及其机制

目的观察苦参碱(Mat)对大鼠肺成纤维细胞增殖及纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)表达的影响.方法体外培养新生Wistar大鼠的肺成纤维细胞,倒置显微镜下观察活细胞形态;四氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞分析仪测定细胞周期;免疫荧光测定FN的蛋白含量.结果不同浓度苦参碱处理36 h后,细胞MTT-OD值呈递减趋势,S期细胞百分率下降,G0/G1期百分率上升,FN的表达下降,且成剂量依赖性,与空白组相比,差异有显著性(P＜0.01).结论苦参碱可抑制大鼠肺成纤维细胞增殖,其作用与降低FN表达有关.     

低氧促进大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成

目的研究低氧(2%氧)对成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成、总蛋白合成及Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA表达的影响.方法分离培养成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞,采用液体闪烁计数方法检测心脏成纤维细胞胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率来观察细胞胶原蛋白合成变化,并检测3H-亮氨酸掺入率观察细胞总蛋白合成的变化,采用RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA的表达.结果成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞在低氧第24、48小时胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率较常氧组显著增加,分别增加132%(P＜0.05)和163%(P＜0.01);低氧12 h起Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA表达显著高于常氧培养的细胞.结论低氧能够直接促进体外培养的成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成和Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA的表达,提示低氧对心脏成纤维细胞胶原合成代谢的直接调节可能是低氧性心肌纤维化的重要机制.     

补肾活血方对大鼠心脏成纤维细胞增殖及胶原表达的影响

摘要：目的探讨补肾活血方对大鼠成纤维细胞增殖及胶原表达的影响,为其抗心肌纤维化提供实验依据。方法通过血清药理
学方法制备补肾活血方含药血清,与DMEM配成细胞培养液。提取大鼠心脏成纤维细胞（CFs）并传代培养,将3~4代CFs分为
4组：A组为10%含药血清培养液培养,B组为20%含药血清培养液培养,C组为不含药血清培养液培养,D组为对照组,为常规胎
牛血清培养液培养。培养72 h后CCK-8检测CFs增殖,RT-PCR检测胶原基因表达,Western blotting检测胶原蛋白表达。结果
与C组、D组相比,A组、B组CFs增殖明显降低,B组较A组进一步降低（P<0.05）;Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA在A、B两组表达较C、
D两组明显下调（P<0.05）,Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达在A、B两组明显低于C、D两组（P<0.05）。结论补肾活血方可以抑制大鼠
成纤维细胞增殖及胶原表达。
     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascu lar smooth musc le cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORC1基因表达抑制后VSMCs增殖的变化。方法实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性(ORC1 A、ORC1 B、ORC1 C)siR-NA组。应用W estern b lot检测ORC1基因表达的变化;应用MTT比色试验、3H-TdR掺入试验检测VSMCs增殖的情况。免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuc lear antigen,PCNA)表达。结果①siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组ORC1基因表达水平均降低,尤以第2对阳性siRNA抑制效果最为显著,而空白对照组及阴性对照组间ORC1基因表达水平无显著差异。②siRNA转染使ORC1表达减弱后,VSMCs的MTT吸光度值3、H-TdR掺入量和PCNA表达量均较空白对照组及阴性对照组显著降低。结论RNA干扰介导的ORC1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。     

醛固酮介导心肌成纤维细胞增殖的机制研究

目的探讨醛固酮诱导心肌成纤维细胞(FBs)增殖及对诱导型一氧化氮合成酶一氧化氮(iN-OS-NO)活性的影响。方法以培养的FBs为模型,用醛固酮剌激FBs增殖,螺内酯阻断醛固酮的作用,检测FBsNO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达,用3H-胸腺嘧啶掺入量作为反应FBs增殖的指标。结果醛固酮呈浓度依赖性的促FBs核酸合成速率明显增高,降低FBsNO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达;螺内酯能明显抑制醛固酮介导的FBs核酸合成速率增高,与醛固酮剌激组相比差异显著(P<0.01)。同时发现醛固酮剌激组NO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达与对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01)。螺内酯抑制醛固酮介导的FBs的上述作用。醛固酮干预下FBs核酸合成速率与NO含量及iNOS活性呈显著负相关(r分别为-0.932和-0.928,均P<0.01)。结论醛固酮通过降低iNOS-NO剌激FBs增殖,螺内酯能逆转上述作用。     

COX-2基因沉默对OS-RC-2细胞生长和侵袭能力的影响

目的：观察RNA干扰沉默肾癌细胞株OS-RC-2的环氧合酶-2（COX-2）基因表达对肾癌细胞生长及体外侵袭能力的影响。方法：构建靶向COX-2的小干扰RNA（siRNA）真核表达质粒pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA。将对数生长期的OS-RC-2细胞分3组,干扰组转染pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA,空转组转染pSliencer2.0-U6,对照组不转染。培养72h后采用半定量RT-PCR、Westernblot检测COX-2mRNA和蛋白表达,CCK8增殖抑制实验观察细胞生长情况,改良Boyden小室法评估细胞体外侵袭能力。结果：酶切和测序证实pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA构建成功。3组细胞COX-2mRNA和蛋白的表达、细胞存活率及穿孔细胞数差异均有统计学意义（F分别为189.800,89.326,188.403和75.349,P均〈0.001）。与其他2组比较,干扰组COX-2mRNA及蛋白表达下调（P〈0.05）,细胞存活率、穿孔细胞数降低（P〈0.05）。结论：COX-2有望成为肾癌基因治疗的靶点。