骨髓间充质干细胞在现代细胞治疗中的潜在作用

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有向多种细胞分化的潜能,参与梗塞部位心肌的修复、成骨和成软骨细胞分化及骨折后的骨功能和结构重建.输入MSC可以预防和治疗移植物抗宿主反应,提高肿瘤患者对化疗毒性的耐受性,增强肿瘤免疫功能.骨髓MSC还可促进造血功能恢复和损伤组织重建.     

间歇性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响

目的:研究间歇性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞(MSC)增殖的影响,探讨假体置换术后活动所需的最适宜压力。方法:以新西兰兔的骨髓基质干细胞为实验材料,通过噻唑盐(MTT)比色试验,观察间歇性压力对骨髓基质干细胞增殖的影响。结果:MSC在60、100 kPa间歇性压力培养环境下MTT反应的OD值小于对照组,压力值越大,OD值越小(P<0.05)。而20 kPa间歇性压力情况可显著促进MSC增殖,并随时间增加而增强。在实验第7天时,实验组OD值高于对照组(P<0.05),差异有显著性意义。结论:关节置换术后早期下地活动产生的较大应力,会明显抑制骨髓腔内MSC的增殖,不利于骨的重建愈合,临床应当避免。然而,较小的间歇性压力对MSC增殖有明显的促进作用,提示关节置换患者可在较小压力范围(<20 kPa)内进行早期关节被动活动训练,有利于关节术后骨的重建愈合。     

Y-染色体特异性探针追踪骨髓间质干细胞移植后转归的实验研究

目的追踪观察骨髓间质干细胞（MSC）移植后细胞的存活、转归和功能保存状况。方法将雄性SD大鼠分离培养的MSC移植到雌性SD大鼠骨缺损部位，动态取不同时段的组织，采用地高辛标记的Y染色体特异性DNA探针进行原位杂交，观察移植细胞的分布、数量和功能状况。结果同种异体MSC移植后，可在受体骨缺损局部生存、增殖，形成骨痂数量多、质量好。干细胞移植90d后仍存活，可分布于骨髓和新骨组织。结论同种异体MSC移植后可长期存活于骨髓和新骨组织并保存成骨特性。     

自骨密质中分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的介绍一种自Wistar大鼠骨密质中分离培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的方法。方法应用骨髓密度梯度离心、酶消化骨密质两种方法分离、培养Wistar大鼠MSC,比较其形态学、体外增殖能力差异;并用碱性磷酸酶染色和油红O染色分别鉴定MSC的成骨和成脂分化潜能。结果采用密度梯度离心骨髓或用酶消化后的骨密质,经贴壁培养后均能够成功分离和培养大鼠的MSC,两者在形态学和体外增殖能力方面无明显差异;且两种方法培养的MSC经特异性诱导剂诱导后,均可向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色及碱性磷酸酶染色均阳性。结论自骨髓和骨密质中均能够分离培养出较为纯化的大鼠MSC,两种方法培养的MSC体外生物学性能无明显差异。     

人骨髓基质细胞诱导成骨细胞和脱钙骨粘附率的研究

目的　研究人MSC诱导为成骨细胞后 ,其在脱钙骨上的粘附特性。方法　采用密度梯度法分离人骨髓中骨髓基质干细胞 ,条件培养液诱导培养至第 3代细胞 ,经相差显微镜观察 ,钙结节茜素红染色 ,免疫组化检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白 ,RT -PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达。不同浓度细胞悬液接种脱钙骨 ,MTT计数未粘附细胞量 ,计算不同浓度下MSC的粘附率 ,单位重量脱钙骨上MSC最多能粘附的细胞数量。结果　MSC经体外诱导形成钙结节 ,Ⅰ型胶原和骨钙蛋白免疫组化结果阳性 ,RT -PCR证实Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达。脱钙骨上接种MSC达到饱和后 ,MSC的粘附率随接种浓度上升而下降。单位重量脱钙骨最多粘附的MSC量为 3 .5×1 0 7/ g。 结论　人MSC在体外经条件培养液诱导可表达成骨细胞表型 ,在脱钙骨上有良好的粘附能力 ,单位重量脱钙骨上存在MSC的最大粘附细胞数量     

人骨髓基质细胞诱导成骨细胞和脱钙骨粘附率的研究

目的研究人MSC诱导为成骨细胞后,其在脱钙骨上的粘附特性.方法采用密度梯度法分离人骨髓中骨髓基质干细胞,条件培养液诱导培养至第3代细胞,经相差显微镜观察,钙结节茜素红染色,免疫组化检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白,RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.不同浓度细胞悬液接种脱钙骨,MTT计数未粘附细胞量,计算不同浓度下MSC的粘附率,单位重量脱钙骨上MSC最多能粘附的细胞数量.结果 MSC经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和骨钙蛋白免疫组化结果阳性,RT-PCR证实Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.脱钙骨上接种MSC达到饱和后,MSC的粘附率随接种浓度上升而下降.单位重量脱钙骨最多粘附的MSC量为3.5×107/g.结论人MSC在体外经条件培养液诱导可表达成骨细胞表型,在脱钙骨上有良好的粘附能力,单位重量脱钙骨上存在MSC的最大粘附细胞数量.     

多发性骨髓瘤患者间充质干细胞的免疫原性及其对免疫功能的调控作用

目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)患者的骨髓间充质干细胞(MSC)的免疫原性及其调控免疫的功能和机制.方法 获取MM患者的骨髓MSC,在低血清培养液中培养和扩增.流式细胞仪检测免疫表型;酶联免疫吸附试验检测MSC培养上清液中细胞因子的分泌水平;混合淋巴细胞反应检测骨髓MSC抑制异体T淋巴细胞增殖的能力;流式细胞仪检测MSC对树突状细胞(DC)吞噬功能的影响;混合淋巴细胞反应检测MM骨髓MSC抑制DC介导的异体T淋巴细胞增殖能力.结果 MM患者的MSC不表达HLA-DR和共刺激分子CD80、CD83、CD86和CD40.MM患者的MSC通过分泌转化生长因子β1 (TGF-β1)和肝细胞生长因子(HGF)抑制异体T淋巴细胞的增殖.MM患者的MSC具有抑制DC吞噬作用的功能;MM骨髓MSC抑制DC分泌白细胞介素12(IL-12),并可以抑制DC介导的异体T淋巴细胞增殖.结论 MM骨髓MSC具有低免疫原性及体外调节免疫的功能,该免疫调节功能与其分泌细胞因子有关.     

纳米丝强化型生物骨水泥治疗椎体骨质疏松骨折的细胞学机制考察

目的分析RGD/纳米壳聚糖强化型磷酸钙骨水泥(CPC)与硫酸钙骨水泥(CSC)对体外间充质干细胞(MSC)粘附、增殖能力及促成骨分化能力的影响。方法取大鼠骨髓MSC,分别与CPC(CPC组)、壳聚糖强化型CPC(CPC-CH组)、RGD基团修饰的壳聚糖强化型CPC(CPC-CH-RGD组)、CSC(CSC组)、壳聚糖强化型CSC(CSC-CH组)以及RGD基团修饰的壳聚糖强化型CPC(CSC-CH-RGD组)体外接触式共培养4周。取培养液检测粘附分子细胞间黏附分子1(ICAM-1)及E选择素(E-selaction)含量、MSC细胞增殖率、凋亡率;并观察成骨细胞分化情况和矿化钙结节,测定成骨分化标记物OC、BMP的m RNA表达水平。结果使用CPC还是CSC作为基质骨水泥对MSC黏附、增殖、凋亡及促成骨分化功能无影响(P>0.05),与强化剂的配伍对MSC黏附、增殖、凋亡及促成骨分化功能有影响(P<0.05)。其中CPC-CH-RGD组和CSC-CH-RGD组ICAM-1水平、E-selaction、MSC增殖率、成骨分化阳性率、钙结节数、OC m RNA表达量,BMP m RNA表达量均偏高,MSC凋亡率偏低,与其他各组相比,差异有统计学差异(P<0.05)。结论 RGD/纳米壳聚糖强化型骨水泥能够促进体外MSC黏附、增殖及促成骨分化功能,可能为其改善骨质疏松患者预后的重要细胞学机制之一。     

凝血酶活化的富血小板血浆促进人骨髓间充质干细胞增殖

目的探索凝血酶活化的富血小板血浆(Thrombin-activated platelet-rich plasma,tPRP)替代牛血清,进行人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stme cells,MSC)分离及培养扩增的可行性。方法分别用MTT法和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯标记细胞技术,观察人骨髓MSC在含有tPRP和胎牛血清培养体系中的增殖状态:利用流式细胞学技术检测细胞表面表型;细胞化学染色法分析不同培养体系所获细胞的成骨及成脂细胞分化能力。结果tPRP培养的人骨髓MSC呈典型的成纤维细胞样形态,且tPRP促MSC增殖能力优于筛选后的胎牛血清。tPRP培养的MSC均表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC,而不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR。体外分化实验显示,利用tPRP培养的MSC具有体外成骨和成脂能力。结论tPRP可以替代胎牛血清,用于人骨髓MSC的培养。     

TLN1-PI3K/AKT通路调控骨髓间充质干细胞成骨分化

［摘要］ 目的 探讨Talin1在骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）成骨分化中的作用及其调控机制。方法 诱导MSC成骨分化后通过qRT-PCR及Western blot检测TLN1的表达变化,在MSC中敲低TLN1后采用CCK-8检测细胞增殖能力改变,利用ALP活性检测及茜素红染色观察成骨分化变化情况。通过Western blot实验研究TLN1在MSC成骨分化过程中参与的分子机制。结果 qPCR及Western blot结果提示,TLN1在成骨分化过程中表达上升;siRNA敲低TLN1表达后,MSC增殖无明显差异,ALP活性及矿化结节定量较对照组下降（P<0.05）。Western blot结果显示敲低TLN1表达后p-AKT表达下降,回补实验证明激活PI3K-AKT表达可回复MSC的成骨分化能力。结论 诱导MSC成骨分化后TLN1表达逐渐上调,敲低TLN1后通过PI3K-AKT通路抑制骨髓间充质干细胞成骨分化。     

TLN1-PI3K/AKT通路调控骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨Talin1在骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)成骨分化中的作用及其调控机制。方法诱导MSC成骨分化后通过qRT-PCR及Western blot检测TLN1的表达变化,在MSC中敲低TLN1后采用CCK-8检测细胞增殖能力改变,利用ALP活性检测及茜素红染色观察成骨分化变化情况。通过Western blot实验研究TLN1在MSC成骨分化过程中参与的分子机制。结果 qPCR及Western blot结果提示,TLN1在成骨分化过程中表达上升;siRNA敲低TLN1表达后,MSC增殖无明显差异,ALP活性及矿化结节定量较对照组下降(P0.05)。Western blot结果显示敲低TLN1表达后p-AKT表达下降,回补实验证明激活PI3K-AKT表达可回复MSC的成骨分化能力。结论诱导MSC成骨分化后TLN1表达逐渐上调,敲低TLN1后通过PI3K-AKT通路抑制骨髓间充质干细胞成骨分化。     

间充质干细胞在移植治疗中的研究进展

间充质干细胞(MSC)是骨髓微环境中一种重要的、具有多向分化潜能的非造血干细胞.体外研究表明,MSC在类似Dexter型的基质培养体系中,具有支持长期培养启动细胞的功能,体内MSC的共输注可促进造血干细胞的植入,加速移植受者的造血重建.同种异体MSC的共输注可抑制同种异体免疫反应,延长移植物的存活时间,降低移植物抗宿主反应.所以人类MSC具有广泛的临床应用前景.     

间充质干细胞在移植治疗中的研究进展

间充质干细胞(MSC)是骨髓微环境中一种重要的、具有多向分化潜能的非造血干细胞.体外研究表明,MSC在类似Dexter型的基质培养体系中,具有支持长期培养启动细胞的功能,体内MSC的共输注可促进造血干细胞的植入,加速移植受者的造血重建.同种异体MSC的共输注可抑制同种异体免疫反应,延长移植物的存活时间,降低移植物抗宿主反应.所以人类MSC具有广泛的临床应用前景.     

补肾中药对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究

骨髓间充质干细胞作为骨损伤后,骨修复、重建的种子细胞,越来越成为骨组织工程学中的研究热点。骨修复、重建的关键核心是如何能够提高骨髓间充质干细胞的高效增殖和成骨定向分化。以"肾藏精,主骨,生髓"的中医理论为依据,同时实验和临床也证实,补肾中药可以有效地促进骨髓间充质干细胞增殖、以及定向成骨分化。为骨损伤之后的修复和重建提供新的治疗途径。笔者就近年补肾中药促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究作一综述。     

兔自体骨髓基质细胞经皮移植修复骨缺损的实验研究

目的 :比较兔骨髓基质细胞 (MSC)与新鲜红骨髓经皮注射到骨缺损处后的成骨能力。方法 :1 8只新西兰兔经穿刺抽取骨髓培养 ,将扩增的MSC收集稀释成悬液 0 .5ml(细胞数约 5× 1 0 6) ,加入 1 0 0ngBMP后经皮注射到兔双侧桡骨缺损中的一侧 ( 1 8侧 ) ,对侧分别注射骨髓 0 .5ml (含BMP 1 0 0ng)( 1 3侧 )。分别于 2、 4、 8周行X线、组织病理学检查。结果 :X线、组织病理切片表明BMP MSC组多数术后 2周有明显的骨痂生成 ,术后 4～ 8周形成骨性连接 ,新骨形成、骨改建及骨髓成熟度指标均优于对照组 ,两行差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。结论 :在相同条件下 ,体外扩增诱导的MSC较新鲜红骨髓有更强、更快的成骨能力。经皮注射MSCs BMP能够迅速促进兔桡骨缺损处新骨形成 ,修复骨缺损。     

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响

目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓基质细胞(MSC)，对其体外诱导后表达成骨表型的影响，探讨EGFP作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，并转染骨髓基质细胞，G418进行筛选。将转染后稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞(MSC-EGFP)进行成骨诱导扩增，以未转染的MSC为对照组，分别检测成骨诱导后碱性磷酸酶(AKP)活性，骨钙蛋白(OCN)含量和成骨细胞转录因子(Cbfal)的表达。结果 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，转染后获得稳定表达绿色荧光蛋白的MSC-GFP，其体外经成骨诱导后，同样能表达成骨特征性表型，AKP，OCN，Cbfal表达和未转染组无明显差别。结论 MSC转染EGFP后，不影响其体外成骨诱导后成骨表型的表达，EGFP可作为骨组织工程种子细胞(MSC)良好的示踪剂。     

骨髓基质干细胞在骨形成蛋白诱导下异位成骨及应用于人造骨的实验研究

目的 研究经分离培养的骨髓基质干细胞（MSC）在骨形成蛋白（BMP）诱导下在体内外的异位成骨效应,为研制一种本身具有成骨能力的人造骨材料提供实验依据。方法 分离、培养Wistar大鼠MSC,体外实验将MSC＋BMP分别在培养板和弥散小室内培养,体内实验将MSC＋BMP与人工珊瑚骨（CHA）制成复合移植体,种植在大鼠背肌内,用形态学、组织化学和免疫组化方法观察其成骨效应。结果 MSC在体外（培养板和弥散小室）只形成软骨基质,在体内复合移植体（CHA＋BMP＋MSC）形成骨质,其成骨效应比对照组A（CHA＋MSC）和对照组B（CHA）强。结论 复合移植体（CHA＋BMP＋MSC）有可能被研制成本身具有成骨能力的人造骨材料。除BMP外,移植体植入的机体和局部还存在其它诱导成骨的因子,进一步探讨这些因子的作用,将对研制这种理想的人造骨材料具有重要意义。     

化疗对结直肠癌患者骨髓间充质干细胞的影响

目的观察化疗对结直肠癌患者骨髓间充质干细胞（MSC）生物学行为的影响。方法分别采集43例结直肠癌患者化疗前、后的骨髓,进行MSC分离培养,观察MSC形态学及生长情况、纤维细胞集落（CFU-F）形成能力、MSC层粘附率和造血细胞混合集落的变化,ELISA检测MSC培养上清中IL-6、SCF、FLT-3L水平。以10例健康成人骨髓作为对照。结果化疗后患者CFU-F形成能力和造血支持功能均显著降低,MSC层粘附率下降,与化疗前及正常对照组比较差异显著,而后两组间差异无显著性;三组MSC培养上清中IL-6、SCF、FLT-3L水平有显著性差异。结论化疗可导致结直肠癌患者骨髓MSC功能损伤,其作用机制可能与造血因子表达下降有关。     

双份脐血移植后受者骨髓间充质干细胞嵌合情况

目的 研究双份脐血移植(DCBT)受者骨髓间充质干细胞(MSC)的嵌合状态.方法 急性粒细胞白血病M2a型男性患者1例,接受改良白消安环磷酰胺方案+抗胸腺细胞球蛋白(ATG)预处理,输注5个抗原(5/6)相合和4个抗原(4/6)相合的非血源脐血各1份,移植后19 d粒系造血重建.移植后87 d,采用密度梯度离心法分离DCBT后受者及正常供者的骨髓单个核细胞,分别培养MSC,用流式细胞术检测细胞表面标志,诱导其向成脂肪细胞和成骨细胞分化,应用逆转录聚合酶链反应法检测MSC表面造血及免疫相关分子的表达,短串联重复序列聚合酶链反应检测受者MSC、外周血、骨髓中供者细胞嵌合率.结果 移植后受者MSC与正常供者MSC具有相似的细胞形态、免疫表型以及分化潜能,均能表达白细胞介素6、干细胞因子、白血病抑制因子和粒-巨噬细胞集落刺激因子等造血及免疫相关分子的mRNA.DCBT后受者骨髓优势脐血嵌合度达96.4％,外周血嵌合度达95.7％,MSC的优势脐血嵌合度为5.4％,MSC中受者本身部分占94.6％.结论 DCBT后,受者造血重建仅来自于其中1份脐血.移植后骨髓MSC大部分来源受者本身,部分嵌合的供者MSC来源于植入的单份脐血.     

帕米膦酸二钠对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的观察帕米膦酸二钠对人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)生物学特性的影响,以探索双磷酸盐导致骨组织损伤的机制。方法人骨髓MSC培养体系中加入不同浓度的帕米膦酸二钠,培养72 h后,MTT法测定490 nm光密度值,观察细胞增殖情况;培养1周后,流式细胞技术检测细胞表面分子表达。体外诱导MSC成骨分化,体系中加入1μg/mL帕米膦酸二钠,1周后PCR法测定细胞Runx-2表达水平,2周后组织化学法测定细胞内碱性磷酸酶活性,以细胞总蛋白量为参照,观察MSC成骨分化的差异。结果 MTT结果显示,在0.1~10μg/mL浓度范围内,帕米膦酸二钠抑制人骨髓MSC增殖,作用呈浓度依赖性,最低作用浓度为1μg/mL,72 h OD490显著低于对照组(P<0.01)。流式细胞检测显示,帕米膦酸二钠处理后,细胞仍均一表达CD44和CD73,不表达CD31和CD45。PCR及细胞化学结果显示,帕米膦酸二钠无促进MSC成骨分化作用,也未提高成骨诱导体系促分化效果。结论帕米膦酸二钠可抑制MSC增殖,不促进其体外成骨能力,可能是长期使用双磷酸盐导致骨损伤的机制之一。