耐辐射球菌pprI基因真核表达载体的构建及其抗辐射作用

目的 研究耐辐射球菌pprI原核基因的真核表达载体的构建及其转染对离体真核细胞急性放射损伤的防护作用。方法 应用DNA重组技术构建pEGFP-c1-pprI质粒;采用脂质体转染技术分别将空载体质粒pEGFP-c1和重组质粒pEGFP-c1-pprI转入人肺上皮细胞系Beas-2B细胞,筛选稳定转染细胞系;应用集落形成实验检测受照转染细胞的生存能力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化;荧光显微镜观察受照细胞ROS荧光强度;免疫荧光实验观察受照细胞不同时间γ-H₂AX焦点数目。结果 成功地构建了pprI原核基因的真核表达载体,并在Beas-2B细胞中表达了PprI融合蛋白,建立了稳定转染细胞系。与空白对照组和空载体组相比,细胞克隆生存曲线显示转染了pprI基因的Beas-2B细胞经不同剂量辐射,其存活分数SF增加,该曲线参数D₀、D_q、N增高;转染了pprI基因的Beas-2B细胞受照后的ROS的荧光强度和不同时间（1、2、4 h）γ-H₂AX的焦点数均显著减低（F=16.73、19.47、6.94,P<0.05）;此外,该细胞G₂期阻滞（F=139.73、237.92,P<0.05）和凋亡率显著减低（F=626.02、2 052,P<0.05）。结论 耐辐射球菌pprI原核基因可在离体真核细胞中稳定表达,并且显著提高受照真核细胞的辐射抗性。     

耐辐射球菌pprI基因对γ射线损伤小鼠的抗辐射机制

目的 研究耐辐射球菌pprI基因活体电转染在哺乳动物γ射线放射损伤中发挥抗辐射作用的机制.方法 采用雄性昆明种小鼠,随机区组法分为健康对照组、单纯照射组、空载体转染组和基因转染组.将自行构建的含有pprI基因的pCMV-HA-pprI质粒注入接受6 Gyγ射线照射的小鼠肌肉内,然后采用活体基因电转导技术将该基因导入细胞内,应用Western blot法对PprI蛋白及其下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物Rad51以及Rad52蛋白表达进行检测.结果 照后1d基因转染组小鼠肌肉组织中PprI蛋白明显表达,7d后未见蛋白表达,其余组小鼠未见蛋白表达;在基因转染组小鼠,肺脏Rad51蛋白于照后第1、7和14天明显表达,明显高于单纯照射组及空载体转染组小鼠,肝脏Rad51蛋白于照后第1天和第28天明显表达,肾脏Rad51蛋白于照后第1天及第14天明显表达;在各组小鼠的肺脏、肝脏组织中检测了Rad52蛋白,其表达无明显规律.结论 耐辐射球菌pprI原核基因成功地在哺乳动物体内细胞表达了PprI蛋白,并作用于下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物rad51基因,使其蛋白表达显著增高而发挥其抗哺乳动物辐射损伤的作用.     

CBLB502蛋白原核表达及辐射防护作用验证

目的 原核表达并纯化TLR5受体的激动剂CBLB502蛋白,验证其辐射防护作用。方法 采用pET28b原核表达系统表达CBLB502蛋白,利用Ni-NTA亲和层析柱亲和层析纯化CBLB502蛋白,经报告基因检测方法结合动物实验评价纯化蛋白活性。结果 成功表达并纯化CBLB502蛋白,纯度可达95%以上,能够激活NF-κB报告基因,可以提高9 Gy照射小鼠存活率,对照组小鼠全部死亡,CBLB502蛋白预防组全部存活。结论 成功表达并纯化CBLB502蛋白,并验证其对小鼠的辐射防护作用。     

耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定

目的 构建耐辐射奇球菌pprM基因缺失回补菌株, 为进一步研究PprM蛋白的功能奠定实验基础。 方法 设计并合成HA-pprM基因(HA为流感病毒血凝素)全长的引物, 以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模板, PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长, 经NdeⅠ酶切后, 与pRADK载体连接并转化大肠杆菌, 经培养、提取质粒及纯化后, 采用酶切鉴定以及基因测序方法确认插入序列的正确性; 采用CaCl₂法将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失的菌株中, 通过Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达。 结果 构建的重组质粒pRADK-HA-pprM经NdeⅠ酶切鉴定结果符合目的条带大小(438 bp), 测序结果显示插入的寡核苷酸序列及方向与预期的一致, Western blot结果显示HA-PprM融合蛋白的相对分子质量约为13000。 结论 笔者成功构建了重组质粒pRADK-HA-pprM, 为进一步研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA的筛选奠定了良好的基础。     

长链胰岛素样生长因子1在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

目的:在毕赤酵母KM71中分泌表达长链-Arg3-胰岛素样生长因子1(LR3IGF-1),并探讨其体外生物活性.方法:人工合成LR3IGF-1基因,构建表达载体pCαA-LR3IGF-1,转化毕赤酵母KM71.筛选重组工程菌株,经诱导表达并从上清中纯化目的蛋白,鉴定其生物活性.结果:诱导上清中存在一8×103 左右的条带,经初步鉴定为目的蛋白条带.每升培养基经纯化后能得到40 mg目的蛋白.纯化后的目的蛋白具有明显的体外刺激NIH 3T3细胞增殖的作用.结论:建立了LR3IGF-1在毕赤酵母 KM71中表达及纯化方法,该方法能获得具有生物学活性的高纯度LR3IGF-1,为LR3IGF-1的后续研究及临床应用奠定了基础.     

重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的作用及辐射敏感性的影响

目的 探讨重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及其辐射增敏性。方法 利用四氮唑盐(MTT)比色法分析重组人p53腺病毒注射液、放射治疗以及两者联合应用对人淋巴瘤细胞Raji 和Daudi的抑制作用;通过蛋白质的Western印迹分析法(Western blotting)分析淋巴瘤细胞内P53蛋白的表达;应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴瘤细胞内p53基因的mRNA表达。结果 MTT结果显示重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞具有一定的抑制作用,但抑制作用不显著,Raji 及Daudi 细胞最大剂量的抑制率分别为27.5%±4.1%和28.1%±1.6%,也未见明显的辐射增敏效应。Western blotting和RT-PCR结果表明,外源性P53蛋白和p53基因的mRNA均有所表达,但未见高效表达和明显的辐射增敏性。结论 重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及辐射增敏性不显著。     

INK4A基因及P16蛋白在辐射诱导小鼠白血病模型中的变化

目的 研究INK4A基因及编码的P16蛋白在辐射诱导的小鼠白血病模型中的改变。方法 7.0 Gy ⁶⁰Co γ射线分4次照射BALB/c小鼠建立辐射诱导的小鼠白血病模型; PCR扩增INK4A 基因第1、第2 外显子,检测等位基因纯合性缺失,甲基化敏感酶切PCR 法检测INK4A基因的甲基化发生情况,并应用PCR单链构象多态性分析方法检测碱基突变的发生;Western blot检测P16蛋白含量改变。结果 在21例白血病模型组织中,外显子2缺失5例,4例发生甲基化,有11例蛋白表达明显下降。结论 辐射诱导的小鼠白血病模型发生过程中伴有P16蛋白表达下降, INK4A基因改变以纯合性缺失和甲基化为主。     

当归多糖对小鼠肝细胞辐照后Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

目的 探讨当归多糖ASP3对小鼠肝细胞培养液辐照后凋亡相关基因bcl-2和bax的蛋白表达的影响。方法 以当归多糖的自制提取物ASP3为受试物,用2.0 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠肝细胞。采用免疫组织化学方法,检测辐射损伤诱发的肝细胞凋亡相关基因bcl-2和bax的蛋白表达。结果 辐射对照组的Bcl-2蛋白表达阳性减弱(55.60%),Bax表达明显增多(70.83%),与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。当归多糖ASP3能够调节辐照肝细胞Bcl-2家族蛋白的表达,即抑制Bax的高表达(64.14%/58.37%),同时提高Bcl-2的表达量(59.21%/67.45%),且高剂量(100 mg/L)ASP3组与辐射对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 当归多糖ASP3对辐射诱导的肝细胞凋亡有抑制作用,并通过提高Bcl-2/Bax比值减少细胞凋亡的发生,进而提高肝细胞的DNA损伤修复能力和辐射耐受性。     

分泌表达rhOPG-HSA融合蛋白的毕赤酵母菌株的构建

目的：将骨保护素（osteoprotegerin,OPG）与人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）基因融合,以构建高效分泌表达的巴斯德毕赤酵母菌株。方法：通过RT-PCR扩增OPG基因,构建pHILD2-HSA-OPG质粒,并对HSA-OPG分泌表达产物进行了ELISA检测。结果：pHILD2-HSA-OPG表达质粒经鉴定与测序证明正确,并在毕赤酵母GS115中能够实现较高表达。结论：成功构建了高效分泌表达重组骨保护素融合蛋白（rhOPG-HSA）的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

高效反义STAT3对A549细胞辐射敏感性的影响

目的 探讨高效反义STAT3转染肺腺癌A549细胞后,肿瘤细胞辐射敏感性的变化,为提高恶性肿瘤的辐射敏感性提供新的探索思路和途径。方法 用自行设计成功的高效反义STAT3(AS10)转染A549细胞后,以不同剂量γ射线照射,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化,Hoechst 33258染色对细胞凋亡作形态学上的观察;用Annexin V/PI复染,流式细胞仪检测细胞早期凋亡率的变化;Western blot检测STAT3蛋白表达及磷酸化变化情况,以及其下游基因表达变化情况。结果高效反义STAT3(AS10)转染后,加以γ射线照射,A549细胞的增殖相比于单独作用组受到明显抑制,细胞早期凋亡水平也增加,STAT3蛋白及其下游Bcl-Xl、Cyclin D1蛋白表达变化明显下降,STAT3蛋白磷酸化水平也降低。结论 反义STAT3(AS10)联合γ射线对A549细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用明显增强,提高了A549细胞的辐射敏感性;表明阻断STAT3蛋白表达可能成为一种新的提高肿瘤辐射敏感性的有效手段。     

神经酰胺在辐射诱导的秀丽隐杆线虫生殖细胞旁效应中的机制研究

目的 利用秀丽隐杆线虫为研究对象,以单粒子束为辐射源,从活体水平探究神经酰胺在辐射旁效应中的作用。方法 以野生型N2和突变体L4期线虫的后食道球为辐射部位,分别给予2 000个质子的辐照剂量,检测和分析成虫的生殖腺凋亡细胞以及基因表达水平。结果 定点辐射N2的后食道球可显著诱导线虫旁区生殖腺细胞凋亡的增加（t=9.007,P<0.05）,但在神经酰胺合酶基因突变体中未表现出这一现象（P>0.05）。实时定量PCR结果显示,辐射诱导N2和神经酰胺合酶基因突变体lagr-1（gk327）;hyl-1（ok976）线虫中凋亡核心通路基因egl-1和ced-13表达量的上升,但两品系线虫间的差异无统计学意义（P>0.05）;辐射可诱导N2和DNA损伤检验点突变体hus-1（op241）中hyl-1和lagr-1表达量的上升,且两品系间的差异无统计学意义（P>0.05）。非受体络氨酸激酶abl-1突变可显著增加辐射诱导的旁区细胞凋亡（t=13.241,P<0.05）,而当神经酰胺合酶基因与abl-1同时突变时,凋亡增加的现象被抑制（t=13.462,P<0.05）。结论 神经酰胺参与线虫体内辐射引起的旁区凋亡过程,且可能与凋亡核心通路中的促凋亡蛋白egl-1和ced-13以及DNA损伤响应通路中的HUS-1协同发挥作用。抑凋亡基因abl-1与神经酰胺合酶在凋亡过程中表现出拮抗关系。     

不同寄主上的桑寄生药材毒性的比较研究

目的： 比较研究不同寄主来源的桑寄生（Taxillus sutchuenensis）药材的毒性。方法： 对6种不同寄主上的桑寄生药材进行急性毒性实验,测定半数致死量（LD₅₀）或最大耐受量（MTD）。并根据寄主来源不同,将98只昆明种小鼠随机分为对照组、沙梨组、李树组、白杨组、柞木组、夹竹桃组和漆树组,除对照组,其余各组小鼠每日ig 7.5 g·kg^-1水提物1次,共4周。测定血清中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）及肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）含量,并观察肝、肾组织病理改变。结果： 夹竹桃上的桑寄生、漆树上的桑寄生毒性明显,LD₅₀及95%可信限分别为109.276 （96.837~122.645） g·kg^-1和77.286（66.891~89.296）g·kg^-1;其余4种寄主上的桑寄生药材未出现死亡。与对照组比较,夹竹桃上的桑寄生能引起Cr指标的升高,并对小鼠肾组织影响较明显;而其他各寄主上的桑寄生组肝、肾功能检测指标差异不明显,对小鼠肝、肾组织损伤也较轻。结论： 寄主为夹竹桃、漆树有毒木类的桑寄生药材有明显的毒性。     

电子顺磁共振在体测量指甲剂量方法的可行性研究

目的 针对核应急医学救援剂量评估的需求,为解决指甲电子顺磁共振（EPR）剂量评估方法中机械诱发信号难以分离的问题,探讨指甲EPR在体测量的可行性。方法 利用自研的指甲在体EPR测量装置,对未剪碎指甲进行整体测量,在无机械诱发信号干扰的条件下研究指甲的本底信号及辐射诱发信号特性,探索通过水处理恢复本底信号的方法;开展指甲实际在体EPR测量实验,评价在体测量条件对EPR波谱的影响。结果 未剪碎指甲的本底信号分布服从正态分布,不同性别志愿者的指甲本底信号差异无统计学意义（P>0.05）;在2~10 Gy范围内建立了剂量响应关系,指甲辐射诱发信号半衰期约为5 d;建立了变温结合水处理的本底信号恢复方法,处理后指甲EPR信号与本底信号差异无统计学意义（P>0.05）;获得了实际在体测量条件下的指甲EPR波谱。结论 利用本方法可以获得不含有机械诱发信号的EPR波谱,初步验证了指甲在体EPR测量用于剂量评估的可行性。     

四物汤对模式生物斑马鱼血液系统与辐射损伤的影响

目的 使用斑马鱼观察中药复方四物汤对辐射损伤血液系统的干预作用,明确斑马鱼是否可应用于中药对血液系统调控的研究。方法 72只体重在0.14~0.20 g的4月龄成年雄性斑马鱼（Danio rerio）用于全部实验,首先取36只斑马鱼用于照射后血液发育动力学的变化观察,另外36只斑马鱼用于四物汤对照射后血液系统的干预作用研究。采用⁶⁰Co γ射线照射,辐射剂量20 Gy,吸收剂量率97.33 cGy/min。在照射后血液发育动力学观察中,9只未照射作为0 d对照,余27只斑马鱼分别于照射后第7、14和30天麻醉,收集外周血细胞和肾髓中细胞,采用流式细胞仪分析细胞的绝对数量。依据照射后外周血和肾髓中细胞的动态变化情况判断血液发育动力学特征,藉此实施四物汤的药效观察。四物汤对照射损伤干预实验周期7 d,36只斑马鱼采用随机数表法分为未照射组、单纯照射组、药物2 000组和药物5 000组,每组9只。两个药物组的斑马鱼按上述条件20 Gy照射后第2天分别置于稀释了2 000倍和5 000倍的四物汤水中饲养,第7天收集各组斑马鱼的外周血和肾髓中细胞,比较判断四物汤对斑马鱼辐射损伤血液系统的干预作用。结果 照射后斑马鱼血液发育动态变化明显,血液系统消融作用在第7天最明显,与未照射比较,斑马鱼的外周血细胞和肾髓总细胞数量分别下降26%和52%,差异均有统计学意义（t=4.535,28.987,P<0.05）,肾髓中髓系单核细胞、淋巴细胞和红细胞数分别下降46%、79%和33%,差异均有统计学意义（t=18.457、66.900、9.872,P<0.05）,前体细胞下降49%,但差异无统计学意义（P>0.05）。照射后第14天肾髓中各种细胞数均呈现上升,第30天恢复至照射前水平以上。斑马鱼照射后第2天开始连续6 d给予四物汤,药物5 000组与单纯照射组比较,肾髓细胞总数、髓系单核细胞、前体细胞和红细胞分别增加了57%、125%、81%和35%,差异均有统计学意义（t=12.128、21.594、15.473、4.594,P<0.05）,淋巴细胞增加了59%,而外周血红细胞数量两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;药物2 000组各参数均与单纯照射组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 照射后斑马鱼血液系统发育呈现明显的先抑后扬的动态变化,一定浓度的四物汤对斑马鱼造血系统照射损伤有明显的干预作用,可为中药血液系统调控方面的研究提供参考。     

Non-invasive imaging of cardiac transgene expression with PET: comparison of the human sodium/iodide symporter gene and HSV1-tk as the reporter gene

Purpose Genes encoding for intracellular enzymes or transmembrane proteins are suitable as reporters, but may differ in terms of applicability for cardiac imaging. The aim of this study was to compare the human sodium iodide symporter gene (hNIS) with the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase gene (HSV1-tk) as the reporter gene in non-invasive imaging of cardiac transgene expression with positron emission tomography (PET).Methods Equal doses of adenoviral vectors encoding for hNIS, wild-type HSV1-tk, mutant HSV1-sr39tk or LacZ as the control gene were directly injected into the myocardium of 34 animals. Two days later, dynamic PET was performed with a clinical scanner, using reporter probes specific for the respective reporter gene. Imaging with ¹³N-ammonia was also performed to identify cardiac regions of interest.Results Kinetics differed significantly: ¹²⁴I as the probe for hNIS showed rapid early uptake, remaining stable over time. Maximal myocardial concentration was 3.61±1.15%. The nucleoside ¹⁸F-FHBG, as the specific probe for HSV1-sr39tk, showed increasing uptake over time, but maximal accumulation was significantly lower (1.45±0.54%, P=0.0009). ¹²⁴I-FIAU, as the specific probe for wild-type HSV1-tk, showed early uptake with subsequent washout. Maximal accumulation was lowest (0.63±0.23%, P<0.0001). Post-mortem analysis by autoradiography and gamma counting confirmed the in vivo data.Conclusion Reporter genes encoding for transporter proteins such as hNIS are an attractive alternative to overexpression of intracellular enzymes for cardiac gene product imaging. hNIS yielded higher signal intensity and imaging contrast for PET than did HSV1-tk and HSV1-sr39tk. Therefore, this approach may be preferable for the future monitoring of cardiac gene- or cell-based therapy.     

Feasibility of sodium/iodide symporter gene as a new imaging reporter gene: comparison with<Emphasis Type="Italic"> HSV1-tk</Emphasis>

Positron emission tomography (PET) imaging reporter genes, such as HSV1-tk and D₂ receptor genes, make it possible to visualise gene expression non-invasively and repetitively in vivo. However, these systems require the synthesis of complicated substrates and the availability of expensive PET equipment. Expression of the sodium/iodide symporter (NIS) gene can be easily monitored with radioiodines and technetium-99m using a gamma camera. To evaluate the possibility of using NIS as an imaging reporter gene, we compared its characteristics with those of the conventional HSV1-tk gene. The CM cell line was made by transfecting the HSV1-tk gene into CT-26 (mouse colon carcinoma cell line). The CTN and CMN cell lines were then made by transfecting the NIS gene into CT-26 and CM. We measured the uptake of iodine-125 iodovinyldeoxyuridine ([¹²⁵I]IVDU) and ¹²⁵I to evaluate the expression of the HSV1-tk and NIS genes, respectively. Each cell line was injected into four flank sites in Balb/c mice. The biodistribution study was performed after intravenously injecting [¹²⁵I]IVDU and ¹³¹I, and ¹³¹I scintigraphy was performed for the evaluation of NIS expression. In vitro studies indicated that CTN and CMN had 40- to 79-fold and 150- to 256-fold higher uptake of ¹²⁵I than CT-26 and CM, respectively. Furthermore, CM and CMN showed 57- to 69-fold higher uptake of [¹²⁵I]IVDU than CT-26 and CTN. NIS gene expression and ¹²⁵I accumulation were found to be directly correlated (R ²=0.923), as were HSV1-tk gene expression and [¹²⁵I]IVDU accumulation (R ²=0.956). Calculated signal per unit NIS and HSV1-tk mRNA expression was 23,240±3,755 cpm and 34,039±5,346 cpm, respectively. In vivo study indicated that CTN and CMN had 2.3- and 5.8-fold higher uptake of ¹³¹I than CT-26 and CM, and 1.8- and 3.5-fold higher uptake of [¹²⁵I]IVDU than CT-26 and CTN. Scintigraphy using ¹³¹I easily visualised CTN and CMN tumours. In conclusion, the NIS gene may be viewed as an imaging reporter gene with comparable performance to the HSV1-tk gene for monitoring target gene expression.     

荧光原位杂交技术分析大剂量照射后Calyculin A诱导的早熟凝集染色体

目的 探索用荧光原位杂交(FISH)技术分析大剂量照射后Calyculin A(CA)诱导的早熟凝集染色体的可行性.方法 采用X射线照射离体外周血,吸收剂量为0、1、5、10、15和20 Gy.RPMI 1640培养基培养,CA诱导染色体早熟凝集,1、4号全染色体探针荧光原位杂交,荧光显微镜下观察,计数畸变阳性细胞数及两条染色体断片数,拟合剂量效应曲线.结果 以阳性细胞作为观察对象,剂量范围在0~15 Gy时,阳性细胞数和照射剂量呈现良好的剂量-效应关系,Y=0.008+0.065D+1.858×10^-5D²(R²=0.994).以断片数作为观察对象,剂量范围在0~20 Gy 时,同样呈现良好的剂量-效应关系:Y=-0.032+0.216D-0.01D²(R²=1.0).结论 用FISH分析CA诱导的早熟凝集染色体,可用于估算大剂量照射后的生物剂量.     

Determination of k0-values for the reactions Zr (n, γ) Zr and Zr (n, γ) Zr–Nb by irradiation in highly thermalized neutron flux

Determination of k₀-factors for zirconium isotopes was performed by co-irradiation of Zr and Au–Al. Due to the highly thermalized irradiation position at FRM-II, interferences from epithermal neutrons were found largely decreased for ⁹⁶Zr (n, γ) ⁹⁷Zr–^97mNb, the reaction with the highest Q₀-value in all (n, γ) reactions. Results showed that, the ⁹⁵Zr k₀-values from this work were the same as the recommended ones. For ⁹⁷Zr–^97mNb 743.4 keV gamma-line, the new k₀-value was 2.8% higher compared to the recommended value, which is not a significant difference. These results are helpful in clarifying the suspicion about the Zr k₀-factors.