人BDNF成熟肽基因克隆及序列分析(英文)

为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗 Alzheimer病中的作用 ,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析。提取健康成人末梢血白细胞基因组 DNA作为模板 ,应用 PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段 ,并将其插入 p GEM-T质粒。限制性内切酶鉴定重组质粒并进行序列测定和分析。与 Gen Bank提供的已知序列(M61181)比较 ,所克隆的人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段长 3 5 7bp,序列完全相同。人脑源性神经营养因子成熟肽基因的克隆 ,为其在原核细胞中的表达、抗体的制备及神经系统疾病的治疗奠定了基础     

乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（core)的人源单链可变区抗体（ScFv)，为得到纯度高、活力强的HBc-ScFv和进一步的抗HBV治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv片段克隆，并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和western blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因；经DNA酶切和序列分析表明，该抗体基因由771个碱基组成；ELISA和western blot结果表明：在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体，具有结合乙型肝炎核心蛋白的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的HBc-ScFv。     

谷胱甘肽转硫酶-血小板因子4融合蛋白表达载体的构建、鉴定与表达

目的 构建谷胱甘肽转硫酶－血小板因子4（GST－PF4）融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法 通过RT－PCR方法，从HL－60细胞中克隆PF4cDNA，然后克隆至载体pUC19中，序列测定后把PF4基因重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEC-4T-3中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果 获得了PF4 cDNA。序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已正确插入到pGEX-4T-3中。重组融合蛋白表达载体GST－PF4经IPTG诱导表达，在SDS－PAGE后得到1条蛋白表达带，相对分子质量（Mr)约为36000。结论 成功地构融合蛋白表达载体GST－PF4，并大肠杆菌中获得有效表达，为进一步研究打下良好的基础。     

人神经营养因子3基因的分子克隆、表达及其产物的生物活性鉴定

以正常中国人血淋巴细胞染色体DNA为模板,PCR扩增出神经营养因子3（NT3）编码基因。将所得基因片段重组于M13噬菌体载体,筛选得到含中国人NT3基因的克隆。采用单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列,该序列与国外文献所报道的完全一臻。将NT3编码基因亚克隆于杆状病毒表达载体,以在大肠杆菌内转座后的重组Bacmid大分子DNA转染悬浮培养的昆虫细胞后,在培养上清中检测到大量成熟型的NT3,后者对人神经母细胞瘤SH－SY5Y－T3具有较强的促进神经突起生长的作用,其生物学效应可被抗人NT3多克隆抗体所阻断。     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

TRAIL胸外段基因克隆及其表达与纯化

目的；克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因（the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex），构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法：抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞，用RT－PCR、巢式－PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA，并克隆到pGEM-T Easy载体中，DNA测序鉴定，将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T，构建重组表达质粒pGEX/TRAILex，用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段，GST－Agarose 4B层析柱纯化GST－TRAILex融合蛋白，Western-blot鉴定纯化产物。结果：抗CD3 McAb能诱导正常人外周血核细胞TRAIL的高表达，成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因，构建了重组表达载体pGEX/TRAILex，IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段，经12％SDS－PAGE分析，可观察到一分子量和理论值相符（约54kD）的诱导表达。Kodak软件分析表达GST－TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28％，进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达，用GST－Agarose 4B层析柱纯化超声破菌后的上清，每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95％以上的GST－Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结论：成功地克隆了人TRAIL基因，并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段，为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

人黄体松弛素原基因的克隆及在大肠杆菌中的初步…

为了加速我国基因工程高技术药物的研制，开发新型，具有生物活性功能的人重组松弛素原，利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人黄体组织克隆了松弛素原的编码基因，包括Ｂ和Ａ链以及连接肽（Ｃ肽）。克隆的松弛素原基因进行序列测定后，再亚克隆的原核表达载体ＬＫＢ２，转化大肠杆菌ＢＬ２１，用ＩＰＴＧ诱导表达，结果表明，克隆的松弛素原基因与已发表的基因序列相同，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达蛋白的分子量为２０ｋ     

人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中，扩增并克隆PD-L1的cDNA，构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果：克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-LI胞外区基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。免疫印迹分析表明，在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白，相对分子质量(Mr)为25000，与理论值的大小相符。该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应。结论：成功地克隆PD-L1基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件。     

SARS冠状病毒受体结合域在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的为了研究SARS冠状病毒感染与免疫和跨种属传播机制，从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒spike蛋白基因中，克隆病毒受体结合域（receptor binding domain，RBD）基因片段，在大肠杆菌中进行表达。方法用PCR方法扩增RBD基因，先经T-A连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序鉴定，双酶切后进一步亚克隆至质粒pGEX-6p-3，构建原核表达重组质粒，通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达，并用SDS-PAGE和Western-blotting方法检测表达情况。结果扩增了RBD的编码基因并成功构建了其原核表达载体pGEX-6p-3-hsRBD和pGEX-6p-3-csRBD，RBD能够在大肠杆菌中获得良好的表达，表达的融合蛋白相对分子质量约为47000。结论本工作利用基因工程技术表达了两物种来源的SARS冠状病毒的RBD，两者具有高度的同源性，因此我们可通过配基受体结合实验，为进一步研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础。     

人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化

为了得到人源性神经营养素-6(N eurotroph in-6,NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Po lym erase cha in reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX 1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy l-βD-th ioga lactos ide,IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM 109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX 1-NT-6;与带有pGEX 1-λT质粒的细菌相对照,pGEX 1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM 109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD。获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的NT-6成熟肽。本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础。     

血管生成抑制因子arresten基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中进行表达。方法:利用聚合酶链式反应(PCR), 由我们构建的重组质粒pGEM-Arr中扩增出arresten基因;采用基因重组技术, 将该基因定向克隆于原核表达载体pRSET中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG诱导表达, 并对表达产物行SDS-PAGE分析。结果:酶切鉴定和DNA测序证实arresten基因正确地插入表达载体中。重组arresten在大肠杆菌中获得高效表达, 其分子量约为26kD, 表达量约占菌体总蛋白量的30%。结论:Arresten基因原核表达载体的成功构建和重组arresten蛋白在大肠杆菌中的高效表达, 为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人PD-L2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人PD-L2基因并构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法 以RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆PD-L2基因的cDNA，构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果 克隆到PD-L2基因cDNA编码区全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。进而构建了PD-L2胞外区的原核表达载体，并在大肠杆菌表达，免疫印迹分析表明在IPTG诱导后表达PD-L2胞外区蛋白，相对分子质量Mr为22000，与理论值大小相符。结论 成功克隆PD-L2基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究PD-L2功能提供了条件。     

His 标记 STAT4(565-748 氨基酸)肽段融合蛋白原核表达及纯化

目的:构建His 标记的人STAT4 C-端565-748 氨基酸肽段原核表达载体,埃希氏菌中诱导表达,并纯化蛋白。方法:PCR 扩增编码STAT4 C-端565-748 氨基酸肽段的基因片段,克隆到pET-28a 原核表达载体,转化感受态细菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,经包涵体变性、复性、树脂纯化、透析。免疫印迹鉴定纯化的融合蛋白。结果:PCR 扩增获得目的片段,克隆到pET-28a,转化感受态细胞,IPTG诱导发现融合蛋白存在于包涵体。经变性、复性、树脂纯化和透析,免疫印迹实验发现融合蛋白表达、被纯化。结论:成功构建人STAT4(565-748aa)肽段原核表达质粒并获纯化融合蛋白。     

人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建人β防御素4(human β defensin 4,HBD4)基因的原核融合表达载体PGEX-4T-2/mHBD4,诱导GST-HBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体.方法:从重组克隆载体PMD18-T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX-4T-2中,在IPTG诱导下,表达GST-HBD4融合蛋白.以表达的融合蛋白GST-HBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GST-HBD4的抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定.结果:在大肠杆菌中成功表达Mr约为32 000的融合蛋白GST-HBD4.ELISA法检测抗血清的效价可达到1:128 000,Western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GST-HBD4特异结合.结论:在大肠杆菌中成功表达了GST-HBD4融合蛋白,并制备了GST-HBD4的抗血清,为进一步研究HBD4蛋白的结构和功能奠定了基础.     

一株A和B亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体的制备及其特性

目的:制备A和B亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)特异性单克隆抗体。方法:用ALV-A-SDAU09C1株的env-gp85基因的PCR产物构建重组表达性质粒pET32a-SDAU09C1-gp85,经IPTG诱导后,表达分子量为53 kD的ALV-A囊膜gp85蛋白与GST的融合蛋白,将表达产物免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选杂交瘤细胞株。结果:获得了1株(A6D1株)能与A和B亚群ALV发生反应但不与J亚群ALV反应的杂交瘤细胞株。Western blot试验结果表明,单克隆抗体识别的A和B亚群ALV囊膜糖蛋白的分子量为53 kD。在IFA中,这株单克隆抗体可以与所试验的3株ALV-A和1株ALV-B毒株反应,而与4株ALV-J亚群的毒株不反应。结论:A6D1株单克隆抗体可以用于A和B亚群ALV感染的诊断和流行病学调查,弥补了目前只有J亚群ALV特异性单克隆抗体可用的不足。     

人脑源性神经营养因子和神经营养素3真核双表达载体的构建与鉴定

背景：脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor,BDNF)和神经营养 素3 (Neurotrophines-3,NT-3)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目的：构建双基因共表达载体pIRES2-BDNF-NT-3并对其进行鉴定。 方法:BDNF和NT-3基因核心序列是通过直接PCR的方法从外周血单个核细胞的基因组DNA中获取。然后将BDNF的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建pIRES2-BDNF-EGFP载体,随后将NT-3 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体。实验通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与 Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的BDNF和NT-3均与基因库报道序列一致。构建的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经Bam HⅠ/NotⅠ双酶切后切出IRES-NT-3片段,经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后切出BDNF-IRES-NT-3片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后的HEK293细胞均能表达BDNF和NT-3 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功采用IRES序列构建了能分别表达的BDNF和NT-3双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin的原核表达与分离纯化

目的：原核表达并分离纯化人细胞骨架调节蛋白基因Nelin。方法：利用DNAstar软件预测Nelin的B细胞表位，选择Nelin基因B细胞表位较多、特异性最强的片段。用DNA重组技术，将此片段插入原核表达载体pE128a（＋），构建C末端带有His6标签的原核表达载体pE128a-Nelin，转化大肠杆菌B121（DE3），IPTG诱导，产物用Ni^2＋金属螯合吸附层析柱纯化。结果：成功构建了pE128a-Nelin表达载体，IFTG诱导后表达分子量约为17000的可溶性蛋白，Nelin-His6蛋白的表达量占菌体总蛋白的18％，经Ni^2＋金属螫合层析柱纯化，得到了电泳纯的Nelin—His6蛋白。结论：建立了稳定的Nelin基因的表达体系，为其功能研究奠定了基础。