脑梗死患者血清脂联素与超敏C反应蛋白的测定及临床意义

目的：探讨脑梗死患者血清脂联素（APN）与超敏C反应蛋白（hs-CRP）的关系。方法：临床及头颅CT明确诊断的脑梗死患者46例为脑梗死组,对照组30例,分别检测其血清APN、hs-CRP水平,并进行比较。结果：与对照组比较,脑梗死组血清APN水平明显降低（P〈0.01）,hs-CRP水平明显升高（P〈0.01）,两者之间呈负相关（r=-0.26,P〈0.05）。结论：脑梗死患者血清APN水平降低,其与hs-CRP之间的相互关系可能促进了动脉粥样硬化的发展,同时也为脑梗死的药物治疗开发提供临床实验依据。     

老年冠心病患者血清淀粉样蛋白A与脂联素的关系及其临床意义

目的探讨老年人中冠心病（Coronary heart disease,CHD）患者血清淀粉样蛋白A（serum amyloidA,SAA）和血清脂联素（serum adiponectin,APN）的关系。方法用酶联免疫吸附法（ELISA法）测定56例老年冠心病患者（冠心病组）和26例老年非冠心病患者（对照组）SAA及ANP水平,并进行比较,了解其相关性。结果冠心病组SAA水平为（8.26±5.26）mg/L,明显高于对照组的（1.26±1.62）mg/L（P〈0.01）;冠心病组APN水平为（3.28±0.26）mg/L,低于对照组的（5.98±0.36）mg/L（P〈0.05）。SAA水平与APN水平呈负相关（r=-0.311,P〈0.05）。结论老年冠心病患者血清SAA水平明显升高,APN水平降低,SAA水平与APN水平呈负相关。     

人脂联素基因在L-02细胞中表达及其功能检测

目的:在人正常肝细胞株L-02中表达外源人脂联素蛋白,并观察其生物学活性。方法:采用脂质体法将成功构建的人脂联素真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin转染L-02细胞;免疫组织化学定位观察脂联素的表达;Western blot检测培养上清及细胞沉淀中脂联素水平;酶联免疫法测定培养基血糖。结果:构建的真核表达质粒能有效转染L-02细胞,并在培养上清及细胞沉淀中检测到脂联素蛋白,该重组蛋白能够降低高糖处理的L-02细胞的血糖水平。结论:重组人脂联素蛋白能在L-02中有效表达,该蛋白定位在细胞质,并且能分泌到胞外,表达产物经体外实验证实具有生物学活性。     

乳铁素的融合表达及其体外抗菌活性鉴定

为降低乳铁素Lf-cinB表达时对宿主细胞的毒害,提高乳铁素的表达量及纯化效果,合成了牛乳铁蛋白肽基因,克隆至E.coli表达载体pTYB11中,构建了与蛋白质内含子(intein)的C端融合的表达载体pTYB11-cinB。重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,融合蛋白intein-cinB主要以可溶形式存在于胞内。利用载体中intein中的chitin结合域,将融合蛋白通过chitin亲和层析一步纯化,经DTT诱导in-tein的自我切割活性,实现Lf-cinB在亲和柱上的切割与分离,透析冻干后得到了纯度94%的重组Lf-cinB。活性检测结果显示,重组Lf-cinB对多种检测菌均有抗菌活性。研究认为,内含肽在抗菌肽的基因工程中具有重要的应用前景。     

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法:利用PCR技术扩增人脂联素基因完全编码序列,选用Gateway原核表达体系,经过BP反应、LR反应两步反应,将PCR产物克隆入pET-DEST42质粒,构建融合表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达脂联素融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,NDSB201高效复性后,使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞,RT-PCR法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶转录水平的影响。结果:成功构建了表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,DNA序列测定结果与预期一致。IPTG诱导表达的融合蛋白经纯化后Western Blot鉴定具有人脂联素抗原性,并可使培养的肝细胞中葡萄糖-6-磷酸酶转录水平下降。结论:获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。     

脂联素影响骨骼肌胰岛素抵抗模型中葡萄糖转运蛋白4表达的研究

目的：通过建立骨骼肌L6细胞胰岛素抵抗模型,探讨骨骼肌L6细胞中脂联素（ APN）的分泌,以及脂联素对骨骼肌胰岛素抵抗模型中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达的影响。方法（1）体外培养大鼠L6成肌细胞,诱导分化后,给予不同浓度的棕榈酸（PA）,测定不同时间细胞培养上清液葡萄糖浓度,观察PA对L6细胞摄取葡萄糖的影响,建立胰岛素抵抗模型;（2）根据实验条件的不同分为三组：NC组（正常对照组,即骨骼肌L6细胞组）;IR组（胰岛素抵抗模型组）;IR＋PIO组（胰岛素抵抗模型＋吡格列酮组）。应用Western blot方法分别测定上述三组APN和GLUT4表达水平。结果（1）0．4 mmol· L^-1的棕榈酸在作用12、24、36 h以及0．6～0．8 mmol· L^-1棕榈酸作用8～36 h后,细胞培养上清液中葡萄糖含量,明显高于对照组。胰岛素抵抗模型建立;（2）Western blot结果显示：①与NC组比较,IR组APN和GLUT4表达均减少,差异有统计学意义;②与IR组比较,IR＋PIO组其APN和GLUT4表达均增加,差异有统计学意义。结论（1）大鼠L6成肌细胞培养并诱导分化后,经过一定条件下PA刺激,可以建立胰岛素抵抗模型;（2）大鼠L6细胞可分泌和表达脂联素,骨骼肌源性脂联素上调L6细胞GLUT4的表达;（3）吡格列酮作为PPAR-γ激动剂,可增加大鼠L6细胞脂联素的分泌,进而改善胰岛素敏感性。     

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16～20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R~2大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10~5个·mL^-1,rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^-1,1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.0...     

重组人胸腺素α1融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人胸腺素α1（Tα1）融合蛋白在大肠杆菌中的表达量，研究了本实验室构建的pET39-Tα1重组质粒在E.coli BL21（DE3）宿主菌中的表达条件。经SDS-PAGE和凝胶成像系统GDS-8000分析结果表明，重组菌以LB为培养基，卡那霉素浓度为50mg／L，开始诱导时的菌体密度为（OD600=0．5，所加IPTG的浓度为0．5mmol／L，27．5℃摇床200r／min振荡诱导培养10h时，可在周至空间中获得高效表达的可溶的Tα1融合蛋白，占周质蛋白总量的64．7％，为下一步纯化工作提供了方便。     

替米沙坦对2型糖尿病大鼠心肌脂联素受体2葡萄糖转运蛋白4表达的影响

目的探讨替米沙坦对2型糖尿病大鼠心肌组织脂联素受体2(AdipoR2)及葡萄糖转运蛋白4(GluT4)表达的影响。方法30只雄性Wistar大鼠,随机分为3组:健康对照组(A组),糖尿病组(B组)和糖尿病替米沙坦治疗组(C组),每组各10只。采用高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法诱导糖尿病模型。用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)的方法测定大鼠心肌AdipoR2mRNA、GluT4mRNA的表达,用免疫组织化学法检测AdipoR2蛋白在心肌组织中的表达,用放射免疫法检测血浆脂联素水平。结果与A组比较,B组糖尿病大鼠心质量/体质量增加,血浆脂联素水平、心肌AdipoR2mRNA和蛋白表达以及GluT4mRNA表达均显著降低。替米沙坦治疗后,C组糖尿病大鼠心质量/体质量降低,血浆脂联素水平、心肌AdipoR2mRNA和蛋白表达以及GluT4mRNA表达均显著升高。结论2型糖尿病大鼠心肌AdipoR2及GluT4表达水平降低。替米沙坦上调2型糖尿病大鼠心肌AdipoR2及GluT4表达,促进心肌葡萄糖氧化,减轻心脏肥大,产生心脏保护作用。     

Kininogen D5和TRAIL融合蛋白的克隆表达及生物学活性的研究

用重组PCR技术得到Kininogen D5和TRAIL的融合编码序列,将该DNA片段克隆到原核表达载体pMAL-c2,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,得到MBP-KT和MBP-TK,经AmyloseResin亲和层析柱层析,得到初步纯化的融合蛋白.结果表明MBP-KT对胰腺癌细胞1990有明显的杀伤作用其作用的ED5.为20 ng/ml,而MBP-TK对1990的抑制作用不明显;同时,MBP-KT和MBP-KD5对内皮细胞ECV304有明显的抑制作用,MBP/KT作用于ECV304的ED50为0.1μg/ml,MBP/KD5作用于ECV304的ED50为9.5μg/ml,但是MBP-TK和TRAIL几乎无作用,表明融合蛋白KT既具抗肿瘤作用又有抗新生血管的作用.本研究为进一步开发靶向性杀伤肿瘤药物奠定了基础.     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin,并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT—PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA,将其克隆入pGEM—T Easy克隆载体中;经全自动序列分析仪测序确证后,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450—1,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得549bp 人 endostastin基因,测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白,此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达,并具有抗血管生成活性,为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆人内皮抑素 (hES)全长cDNA ,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法 :用RT PCR从胎肝RNA中扩增hEScDNA片段 ,构建重组其克隆和融合蛋白表达载体 ,并进行克隆基因的DNA序列分析。结果 :克隆了hEScDNA ,其序列和国外报道一致 ;构建了重组hES融合蛋白表达菌株 ,表达目的蛋白达菌体总蛋白的5 0 %以上。结论 :通过hES基因克隆和表达的研究 ,获得了hES的基因克隆和高效表达菌株     

抑肽酶基因的克隆和表达

抑肽酶作为天然非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，用途广泛。目前抑肽酶制品主要从牛肺中提取。用基因重组技术，将抑肽酶结构基因导入表达载体pGrxA，并在抑肽酶基因上游引入FXa识别位点。将重组质粒转化至Origami^TM中，用异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白，产物以可溶性形式存在于胞内。将菌体超声破壁和离心，融合蛋白经分子筛层析和离子交换层析纯化后，用FXa切割该融合蛋白可得到N端不含多余氨基酸残基且与天然构像一致的活性抑肽酶。     

大肠杆菌表达系统的研究进展

近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

重组质粒Eg.EF-1/pGEX-6P-1的构建及原核诱导表达

将细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus,Eg.）延伸因子（Elongation factor 1,EF-1）与pGEX-6P-1构建成重组质粒并进行表达、纯化及对其特性进行鉴定.将构建好的EF-1/pGEM-T经双酶切后获取目的基因片段,定向重组于表达载体pGEX-6P-1并转化大肠杆菌（Escherichia coli）E.coli BL21,IPTG诱导表达,用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,特异性蛋白解离酶PreScission^TM Protease酶切融合蛋白从中获取重组Eg.EF-1;SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物.获得的Eg.EF-1/pGEX-6P-1/E.coli BL21菌株,诱导表达融合蛋白和纯化分离得到的31 ku Eg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别.证明成功构建出具有有效表达的Eg.EF-1/pGEX-6P-1菌株,初步证实重组蛋白具有较好的抗原性.     

重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定

利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶(L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化入BL21(DE3)。乳糖诱导使其表达,其中80%以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质。将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95%以上。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性。     

Expression,purification and activity assay of recombinant human thymidylate synthase

Thymidylate synthase (TS, E.C.2.1.1.45) catalyzes a critical reaction in the only pathway of de novo synthesis of thymidylate (dTMP) in human cells, and is an important target of chemotherapy. To evaluate the inhibitory activities of novel compounds to TS, a convenient method of activity assay using 6x His-tagged recombinant human TS (rhTS) was established and 49 novel synthetic folate analogues were screened to discover potential TS inhibitors. During the process, 4 novel compounds were found to effectively inhibit TS, while the IC50 of a positive control raltitrexed was 3.4 μM in this assay.     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.