星形胶质细胞AQP9在高渗液中的表达变化

目的 研究星形胶质细胞水通道蛋白-9(aquaporin-9,AQP9)在高渗培养液中的表达变化及AQP9在高渗性脱水中的作用.方法 取生后2 d的新生Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,分别予不同程度的高渗堵养液作用于细胞,建立星形胶质细胞对高渗液反应的实验模型.通过免疫细胞化学和PT-PCR方法研究星形胶质细胞对高渗液的反应及AQP9mRNA和蛋白的表达变化.结果 星形胶质细胞经渗透压为320、333 mmol/L的培养液作用3、6、12、24 h后,AQP9 mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P<0.05),尤以作用6 h后较明显,而且AQP9 mRNA和蛋白的表达呈显著正相关(r>0.7971,P<0.01).结论 高渗引起AQP9基因表达上调,AQP9在高渗性脱水的早期可能起到重要的代偿作用.     

低渗液对AQP4蛋白在体外培养星形胶质细胞中的表达变化

目的　研究低渗培养液对星形胶质细胞AQP4蛋白的表达变化 ,并探讨其在脑水肿中的作用机制。方法　取出生后 2d的Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养 ,分别予不同程度的低渗培养液作用于星形胶质细胞 ,建立星形胶质细胞对低渗压反应的实验模型。应用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法测定细胞活性 ,采用免疫细胞化学法检测AQP4蛋白的表达 ,通过光镜观察低渗液对星形胶质细胞形态学影响。结果　体外培养的星形胶质细胞在不同程度的低渗培养液作用 3、6、12、2 4h后 ,各时相点的AQP4蛋白表达水平均明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,而且与作用时间和低渗压的程度密切相关 ;在光镜下 ,星形胶质细胞出现典型的细胞水肿形态学改变 ,其活性明显下降。结论　低渗液可导致星形胶质细胞水肿 ,AQP4蛋白表达增强 ,而且AQP4表达上调与低渗压的程度和作用时间有关 ,抑制AQP4的表达可能为脑水肿的治疗提供新的理论依据。     

高渗液对体外培养星形胶质细胞中水通道蛋白4 mRNA表达的影响

目的　研究体外培养星形胶质细胞高渗状态下水通道蛋白 4 (AQP4 ) m RNA表达的变化特点及其所起的作用。方法　取生后 2 d的新生 Wistar大鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯培养 ,分别用不同渗透压的高渗培养液作用于星形胶质细胞 ,建立星形胶质细胞对高渗反应的实验模型 ;采用原位杂交、乳酸脱氢酶(L DH)活性测定及图像分析等方法 ,研究体外培养星形胶质细胞对高渗液的反应和 AQP4 m RNA的表达规律。结果　 32 0、333和 345 m mol/ L的高渗培养液作用于星形胶质细胞 3、6、12和 2 4 h后 ,L DH活性测定的吸光度 A值在各时间点均显著高于对照组 (P均 <0 .0 5 ) ;原位杂交分析表明 ,AQP4 m RNA表达明显增高 ,与正常组相比有显著意义 ,尤以高渗液作用 12 h时最明显 ,而且与作用时间及渗透压相关。结论　在高渗状态下 ,细胞活性明显下降 ,AQP4 m RNA表达增强。 AQP4可能在高渗性脱水的早期起重要的调节作用。     

星形胶质细胞水通道蛋白-4在高渗液中的表达变化

目的研究高渗培养液对体外培养星形胶质细胞表达水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP4)的影响及AQP4在高渗性脱水中的作用.方法取生后2 d的Wistar大鼠的大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,分别予不同程度的高渗培养液作用于星形胶质细胞,建立星形胶质细胞对高渗液反应的实验模型.通过形态学观察、PT-PCR、免疫细胞化学、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及图像分析等方法,研究体外星形胶质细胞对高渗液的反应及AQP4 mRNA和蛋白的表达变化.结果高渗组各时相点吸光度A值均低于对照组(P＜0.05),星形胶质细胞表现出特征性的细胞脱水形态学变化,AQP4mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P＜0.01),尤以作用12 h后最明显,而且AQP4 mRNA和蛋白的表达呈显著正相关(rs＞0.8485,Ps＜0.01).结论在高渗状态下,AQP4 mRNA和蛋白的表达增强,AQP4表达上调在高渗性脱水的早期(＜12 h)可能起到重要的代偿作用.     

谷氨酸引起培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4表达动态变化

目的研究谷氨酸是否引起培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达变化。方法利用传代培养至10d左右的大鼠星形胶质细胞,给予1mmol/LL-谷氨酸钠,分别作用1h、3h、6h、12h、24h、48h后进行细胞形态学观察、GFAP免疫化学染色及荧光定量PCR检测AQP4mRNA表达变化。结果谷氨酸作用1h后星形胶质细胞出现肿胀并随着作用时间延长肿胀持续,AQP4mRNA3h时开始出现表达降低(P0.05),后随谷氨酸作用时间延长先下调后上调,12h达最低(P0.01),48h升至高于正常(P0.05)。结论AQP4可能在谷氨酸引起星形胶质细胞肿胀发生发展中发挥作用。     

培养星形胶质细胞缺氧/复氧时水通道蛋白4表达的变化

目的:探讨缺氧/复氧对体外培养星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达的影响.方法:培养的大鼠脑皮层星形胶质细胞分成两组:正常对照组和缺氧/复氧组.缺氧8 h后复氧.根据复氧时间不同,又分为复氧0、4、6、8、12、24 h 6个亚组.于各时间点以检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率,Western blot法检测AQP4的表达.结果:缺氧8 h后随着复氧时间的延长,细胞存活率逐渐降低,至复氧12 h时,达最低,仅有对照组的81.3%,至复氧24 h,又有轻度增加;LDH的漏出率逐渐增多,至复氧24 h达最高峰.AQP4表达随着复氧时间延长而逐步增多,至复氧12 h时达最高峰,为正常对照组的(2.52±0.35)倍,24 h时略有下降.结论:缺氧/复氧过程能对体外培养的星形胶质细胞产生损伤作用的同时,发生了AQP4的表达时程变化.     

低渗液体外培养对气道上皮黏液分泌的影响及与水通道蛋白-5表达的相关性研究

目的 探讨体外气液界面培养气道上皮在低渗液条件下黏液分泌与水通道蛋白-5（AQP5）表达间的关系，以进一步阐明渗透浓度、AQP5在慢性气道黏液高分泌过程中的地位和作用。方法利用体外气液界面细胞培养模型，进行兔气道上皮细胞原代培养。培养1周后，培养液渗透浓度换为235mmol／L（实验A组）、255mmol／L（实验B组）、270mmol／L（实验C组）和282mmol／L（对照组）。培养12h后，采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测各组AQP5mRNA表达，采用蛋白质免疫印迹法检测上清液中黏蛋白5AC（MUC5AC）分泌量。结果 倒置显微镜下各培养组细胞成多层生长。各实验组中MUC5AC分泌量均高于对照组（P〈0．001），其中以实验A组为最高；而AQP5 mRNA均明显低于对照组（P〈0．001），以实验A组为最低；实验组AQP5mRNA表达与MUC5AC呈显著负相关（r=-0.77，P〈0.001）。结论 在气液界面细胞培养模型中，低渗液条件下MUC5AC分泌量显著增加，较好地模拟了慢性气道炎症黏液高分泌的体内环境；AQP5mRNA表达与MUC5AC呈显著负相关。低渗环境以及由此引起的AQP5mRNA表达可能参与慢性阻塞性肺疾病黏液高分泌的形成过程。     

细胞松弛素D对大鼠脊髓星形胶质细胞水通道蛋白和内向整流性钾通道4.1 基因表达的影响

目的探讨不同浓度细胞松弛素D(CytD)对大鼠脊髓星形胶质细胞骨架重构,水通道蛋白(AQP)1、AQP4 及内向整流性钾通道4.1(Kir4.1)基因表达的影响。方法原代培养大鼠脊髓星形胶质细胞,加CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40μg/ml、0.80 μg/ml 和1.00 μg/ml 共培养2 h、12 h 和24 h。MTT法检测细胞增殖情况;鬼笔环肽联合Hoechst 33342 套染后激光共聚焦显微镜下观察共培养2 h 后细胞骨架重构情况;RT-PCR法检测共培养2 h 时AQP1、AQP4 和Kir4.1 mRNA表达水平。结果细胞生存率随CytD 浓度升高和作用时间延长而减少。CytD 使大鼠脊髓星形胶质细胞微丝发生解聚、弯曲,但极性未失。CytD 0.05μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml 和0.40 μg/ml 上调AQP1、AQP4 和Kir4.1 mRNA表达。结论适当浓度CytD可以重建星形胶质细胞骨架,上调大鼠脊髓星形胶质细胞AQP1、AQP4和Kir4.1基因表达。     

半乳糖凝集素-1对低氧去血清培养星形胶质细胞表达和分泌BDNF的影响

目的：研究不同浓度半乳糖凝集素-1（Gal-1）对低氧去血清培养的星形胶质细胞表达和分泌脑源性神经营养因子（BDNF）的影响。方法：建立星形胶质细胞原代培养,设定10mg／L Gal—1组、1mg／L Gal-1组、0．1mg／LGal-1组和对照组分别予以10、1、0．1、0mg／LGal-1干预并进行低氧去血清培养,在低氧去血清培养1h、3h、6h、12h、1d、3d时通过RT—PCR、Western blotting、ELISA检测星形胶质细胞BDNFmRNA、蛋白的表达水平和培养上清液中细胞分泌的BDNF的浓度。结果：与对照组比较,10mg／L Gal—1组低氧去血清培养3h～1d星形胶质细胞合成BDNF持续增加,6h～3d星形胶质细胞分泌BDNF明显增多,均以6h时最为明显;1mg／L Gal-1组低氧去血清培养12h--1d星形胶质细胞合成BDNF明显增加,但分泌BDNF没有明显变化;0．1mg／L Gal-1组对低氧去血清培养各时问点星形胶质细胞表达和分泌BDNF均无明显变化。结论：10mg／L Gal-1能有效促进低氧去血清培养的星形胶质细胞表达和分泌BDNF;Gal-1可能通过此途径在脑缺血后起到神经保护作用。     

以天麻和钩藤为主的中药制剂干预体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠碱性成纤维细胞生长因子及其受体的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子及其受体在体外模拟脑缺血再灌注损伤中的表达变化及以天麻和钩藤为主的中药制剂——抗呆Ⅰ号对其的影响。方法:实验于2002-03/2004-04在科学实验中心完成。先分别进行大鼠大脑皮质星形胶质细胞和神经元的分离纯化培养及体外模拟脑缺血再灌注损伤模型的建立,然后分别进行下列实验:①按随机数字表法将传代后培养5d的星形胶质细胞分为正常对照组、缺血再灌注模型组和缺血用药组(应用抗呆Ⅰ号),在体外模拟脑缺血4h和再灌注3h,18h,24h,36h,48h和72h后行碱性成纤维细胞生长因子的免疫细胞化学染色。②用再灌注18h后收集的星形胶质细胞条件培养液、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液及星形胶质细胞条件培养液与抗呆Ⅰ号联合应用以1∶5的浓度来培养损伤后的神经元,再对其培养的神经元行碱性成纤维细胞生长因子受体的免疫组化染色。结果:①体外培养大鼠的大脑皮质星形胶质细胞在模拟脑缺血再灌注损伤后各时相点分泌碱性成纤维细胞生长因子的能力均显著高于正常对照组(P<0.05～0.01);除再灌注72h外,其余各时相点缺血用药组碱性成纤维细胞生长因子的表达水平均显著高于缺血再灌注模型组(P<0.05～0.01)。②星形胶质细胞条件培养液组、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液组和联合应用组脑缺血再灌注损伤后各时相点的碱性成纤维细胞生长因子受体表达水平大多显著高于缺血再灌注模型组(P<0.05～0.01),均在再灌注18h时达到高峰,其作用强度为经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液>联合应用>星形胶质细胞条件培养液。结论:体外模拟脑缺血再灌注损伤使星形胶质细胞表达碱性成纤维细胞生长因子的能力增强,星形胶质细胞条件培养液能促进受损神经元碱性成纤维细胞生长因子受体的表达。抗呆Ⅰ号可增强受损神经组织的分泌功能,促进其损伤后的修复。     

体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型

目的复制体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型。方法利用传至第2代的体外培养的大鼠星形胶质细胞进行细胞划伤实验。分别于划伤前10min、划伤后1、3、6、12、24h观察细胞形态变化,并取培养上清液进行乳酸脱氢酶活性测定。结果细胞划伤后划痕两侧边缘整齐,随时间推移细胞突起逐渐向划痕区延伸,且划痕区出现星形胶质细胞。细胞划伤后乳酸脱氢酶漏出量短时间内迅速增加,之后各时间点持续增加(P<0.05),且均高于相应时间点的对照组(P<0.05)。结论细胞形态变化及培养上清液中乳酸脱氢酶漏出量证实体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型复制成功。     

大麻素对星形胶质细胞谷氨酸释放的影响及机制研究

目的:观察人工合成大麻素HU210对体外培养中脑腹侧被盖(VTA)区星形胶质细胞谷氨酸释放的影响,并探讨抑制星形胶质细胞谷氨酸释放的药物治疗途径。方法:体外培养大鼠VTA脑区星形胶质细胞,RT-PCR及免疫荧光染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及大麻素受体1(CB1R)的表达。将培养的星形胶质细胞分为4组:对照组(培养基中只加入0.2%DMSO),HU210组(培养基中加入3μM HU210),HU210+AM281组(培养基同时加入3μM HU210及3μM AM281)和HU210+Riluzole组(培养基同时加入3μM HU210及3μM Riluzole),各组4孔。干预30 min后,采用谷氨酸检测试剂盒观察各组星形胶质细胞培养基中谷氨酸浓度。再培养VTA脑区星形胶质细胞,分为对照组(培养基中只加入0.2%DMSO)和Riluzole组(培养基中加入3μM Riluzole),干预30 min后,利用Western Blot印迹分析Riluzole干预后谷氨酸转运体-1(GLT-1)表达水平的变化。结果:RT-PCR及免疫荧光染色显示,星形胶质细胞内有广泛CB1R的表达。与对照组比较,HU210组星形胶质细胞谷氨酸的释放显著增加(P<0.01),HU210+AM281组及HU210+Riluzol组星形胶质细胞谷氨酸的释放较HU210组均显著降低(P<0.01);且HU210+Riluzol组星形胶质细胞的GLT-1表达较对照组升高(P<0.05)。结论:HU210可能通过激活星形胶质细胞的CB1R促进星形胶质细胞释放谷氨酸。Riluzole可能通过升高星形胶质细胞的GLT-1的表达,逆转HU210所致的谷氨酸释放。     

缺氧对视网膜Mfiller细胞水通道蛋白4表达的影响

目的观察体外培养兔视网膜Mtiller细胞在缺氧条件下水通道蛋白4（AQP4）表达的变化。方法本实验以体外培养的兔视网膜Muller细胞为研究对象,选定不同缺氧时间体外培养MUller,并采用AO／EB染色检测MUller细胞的凋亡情况,根据细胞凋亡情况选定最适缺氧时间进行检测,利用免疫细胞化学染色、流式细胞术及RT-PCR的方法对实验组细胞AQP4的表达进行定性及定量测定。结果Muller细胞缺氧24h为缺氧最大耐受时间。缺氧组Mtiller细胞AQP4表达明显低于正常对照组;流式细胞仪检测中波峰位置明显提前,AQP4表达减少;RT-PCR半定量分析显示：AQP4mRNA的表达比对照组明显降低（P〈0．01）。结论缺氧使体外培养兔视网膜Mailer细胞AQP4表达下调,缺氧可能影响细胞代谢变化,引起K＋外流。