用蛋白质组学技术分析鼻咽癌细胞系放射生物学特性的初步结果

目的应用蛋白质组学技术观察不同鼻咽癌细胞系中蛋白表达的差异,以期寻找与鼻咽癌细胞系放射生物学特性相关的蛋白。方法提取细胞总蛋白进行双向凝胶电泳、MALDI-TOF肽质谱指纹图分析、质谱数据的蛋白质库搜寻鉴定。应用Western Blot检测细胞中蛋白质表达。结果差异表达最为显著的蛋白质有9个,与5-8F细胞比较6-10B细胞中4个为下调蛋白,5个为上调蛋白。Western Blot证实CK19和p73在5-8F和6-10B中的表达与蛋白质组结果一致,p73在5-8F中的表达高于6-10B,CK19在6-10B中的表达高于5-8F。结论放射生物学特性不同的鼻咽癌细胞系中存在差异表达蛋白,这可能与其放射生物学特性有关,其中p73可能成为预测的侯选标志物。     

小细胞肺癌细胞系SBC-5蛋白质组双向凝胶电泳图谱的建立

目的:建立人小细胞肺癌细胞系 SBC-5 蛋白质组双向凝胶电泳图谱.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离 SBC-5 细胞总蛋白质,凝胶银染显色,PDQuest图像分析系统分析,从凝胶中选取1个分离较好的蛋白质点,应用基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术(MALDI-TOF-MS)和数据库搜索鉴定蛋白质.结果:获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,三块胶平均蛋白质点数为1116±64,匹配率达84%.蛋白质点分布以 PI 4-7、相对分子质量20 000-80 000范围内最多.1个蛋白点通过质谱分析和数据库检索得到了初步的鉴定.结论:建立了人小细胞肺癌细胞系SBC-5蛋白质组双向电泳参考图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础,也为人小细胞肺癌蛋白质组表达数据库的建立提供了有意义的数据.     

miR-516b-5p靶向ATM调控鼻咽癌细胞HONE1DNA修复的机制研究

目的 探讨鼻咽癌细胞HONE1中抑制DNA修复的潜在机制.方法 使用ETP处理鼻咽癌细胞HONE1造成DNA损伤后,通过高通量测序检测鼻咽癌细胞HONE1中miRNA的表达谱.过表达差异miRNA后,通过基于I-PpoI的可诱导DSB系统检测DNA双链断裂处(DNA double-strand breaks,DSB)的...     

泰索帝对人鼻咽癌细胞系CNE-1的放射增敏作用

泰索帝是从植物ｔａｘｕｓｂａｃｃａｔａ的针叶中提取出来并经过半合成改造而成的 ,其基本核与泰素相似 ,只是在侧链有所不同 ,与泰素无完全的交叉耐药性 ,但对微管的作用与泰素相比有质和量的差别。有关泰索帝放射增敏作用的研究非常有限 ,且结论不同。笔者通过成克隆分析法研究泰索帝对人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ 1的放射增敏作用。一、材料与方法1 .细胞系及培养方法 :人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ 1由中国预防医学科学院病毒研究所提供。于 37℃ ,5 %ＣＯ2 培养箱内 ,用含 1 0 %胎牛血清的ＲＰＭＩ 1 640 (ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司 )培养液在培养瓶内…     

双向凝胶电泳在肿瘤研究中的应用进展

肿瘤的发生是机体正常细胞在多因素、多基因作用下经过多途径而发生转化的结果，这一癌变的过程都是通过基因及其相应的蛋白质来发挥作用的。过去的十多年中，人们在基因水平上对肿瘤进行了广泛的研究，但基因的功能活动最终要靠蛋白质来执行，因此有必要从蛋白质整体水平上来研究肿瘤的发生、发展机制。目前以双向凝胶电泳(two dimensional gel electrophoresis，2-DE)和质谱(mass spectrometry，MS)为代表的蛋白质分离、鉴定技术及生物信息学是肿瘤蛋白质组学研究的支撑技术。本文就双向凝胶电泳技术在肿瘤研究中的应用进展作一综述。     

2D-PAGE电泳和质谱分析筛选鼻咽癌中NESG1调控蛋白

[目的]利用蛋白质组学筛选抑癌候选基因NESG1在鼻咽癌中可能调控蛋白.[方法]提取NESG1稳定高表达的鼻咽癌3D8和对照鼻咽癌C6细胞蛋白,并采用双向凝胶电泳(2D-PAGE)技术进行有效分离,图像扫描后获得高分辨率的2D-PAGE图谱.选用差异蛋白质组学技术筛选差异蛋白位点,然后用肽质量指纹谱(PMn和数据库检索技术给予鉴定.荧光定量PCR和Western Blot验证差异基因表达水平.[结果]质谱分析显示,PKM2 、ERO1L和BCAS2在NESG1过表达的3D8细胞中表达下调,其下调倍数分别为-5.25,-3.65和-4.52倍.荧光定量PCR在mRNA水平验证了PKM2、ERO1L和BCAS2(-3.65、-3.42和-4.55倍)以及Westem Blot在蛋白水平验证了PKM2和ERO1L蛋白在3D8细胞中表达下调.[结论]PKM2、ERO1L和BCAS2可能是NESG1调控的靶基因,参与了NESG1介导的鼻咽癌生长抑制     

人高、低转移大细胞肺癌细胞株双向凝胶电泳图像分析

背景与目的　肺癌转移是肺癌的恶性标志和特征,也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。 为了更好地了解和阐明肺癌转移的分子机制,发现早期诊断和逆转肺癌转移的分子标志物,本研究应用双向 凝胶电泳技术,比较人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和人低转移大细胞肺癌细胞株(NL9980)间蛋白质组 表达的差异。方法　利用固相pH梯度双向凝胶电泳,分离L9981和NL9980细胞株的总蛋白,用图像分析 软件比较分析并识别细胞间的差异表达蛋白质。结果　应用比较蛋白质组学技术对L9981和NL9980细胞 株的蛋白质表达进行双向电泳分离,成功地获得了蛋白组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱。在三次 重复实验结果中,在L9981和NL9980细胞株中检测到的蛋白质点数分别为902±169和941±173,蛋白质斑 点位置在IEF方向的平均偏差为(0.858±0.076)mm,在SDS PAGE方向的平均偏差为(1.514±0.127)mm, 蛋白质表达量的变异为12.06%～12.22%。经ImageMaster软件分析后发现有15个蛋白质点仅在L9981 肺癌细胞株中检测到有表达,27个蛋白质点仅在NL9980中检测到有表达。发现4个蛋白质点在两种肺癌 细胞株中均存在,但在两种细胞株间的表达量差异在2倍以上,其中3个蛋白质点在L9981中表达量显著高     

双向凝胶电泳图像分析方法的建立

目的: 建立一套双向凝胶电泳图像分析方法,为下一步差别蛋白的鉴定提供依据.方法:采用一步法分别提取人永生化食管上皮细胞系SHEE和由SHEE转化而来的食管癌细胞系SHEEC的可溶性总蛋白.经双向凝胶电泳分离后,应用Bio-Rad公司的双向电泳凝胶图像分析软件PDQuest 6.2分析SHEE与SHEEC之间可溶性总蛋白的差异表达情况.结果:SHEE和SHEEC细胞的双向电泳图谱经背景消减、点检测和匹配后,获得了各自的差异蛋白点.其中有7个蛋白点只出现在SHEE细胞中,有2个蛋白点只出现在SHEEC细胞中.结论:利用PDQuest 6.2凝胶图像分析软件可快速有效地对两个密切相关的生物系统之间蛋白质样品双向凝胶电泳结果的差别进行分析处理.     

人鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系与其亲代细胞系比较基因组杂交研究

目的：比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）是一种在荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridiza?tion,FISH）技术上发展起来的用于检测两个基因组间相对DNA拷贝数的改变（缺失或扩增）, 并将这些变化在染色体上进行定位的分子细胞遗传学方法。为了解鼻咽癌紫杉醇耐药细胞 （CNE1/Taxol, HNE2/Taxol, 5-8F/Taxol）与亲代细胞（CNE1, HNE2, 5-8F）在基因组DNA水平上可能存在的差异, 以及这种差异在肿瘤获得性耐药产生中的意义, 采用CGH技术对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞与亲本细胞的基因组DNA进行检测和分析。方法：三株鼻咽癌紫杉醇耐药细胞采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法诱导而成。采用集落形成实验测定药物的敏感性,利用比较基因组杂交技术 （CGH） 对耐药细胞和其亲本细胞的基因组DNA进行检测和分析, 比较耐药细胞与亲本细胞在染色体扩增与缺失上的共同点和差异。结果：三株鼻咽癌紫杉醇耐药细胞耐药指数分别为8.43、 8.27和5.26。鼻咽癌亲本细胞存在广泛的染色体改变,主要表现在3q21-qter, 5p13-pter, 12和20q11-qter的共同扩增以及10q11-qter, 18和X染色体的共同缺失,从亲本细胞系诱导的三株鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系表现为3q21-qter, 5p13-pter, 12,20q11-qter和8q21-qter的共同扩增, 无明显共同缺失区域。与亲本细胞共同扩增区域相比, 其中最有意义的是8q21-qter区域在三株耐药细胞中出现了新的共同扩增。结论： 3q21-qter, 5p13-pter, 12和20q11-qter的共同扩增以及10q11-qter,18和X染色体的共同缺失可能与鼻咽癌的发生有关, 而8q21-qter染色体扩增可能与鼻咽癌获得性紫杉醇耐药相关,对这些区域的进一步研究, 有可能为肿瘤发生及耐药机制研究提供新的线索。     

双向凝胶电泳分析三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡

背景与目的:三尖杉酯碱(harringtonine,HT)作为一种抗肿瘤药,已广泛用于治疗急、慢性髓系白血病,并已获得了良好的疗效。目前的研究表明其抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关,但具体分子机制不详。本研究主要是分析HT诱导K562细胞凋亡的蛋白谱,寻找凋亡相关蛋白。方法:应用AnnexinⅤ和PI双染法,通过流式细胞术区分HT诱导K562细胞凋亡早期和凋亡晚期阶段;进一步采用双向凝胶电泳技术和计算机辅助图像分析方法,对HT诱导凋亡的K562细胞与对照K562细胞进行分离和比较。结果:10μg/mlHT作用于K562细胞5h和24h,凋亡早期细胞(AnnexinⅤ+/PI-)分别为28.3%和18.1%(P<0.01),凋亡晚期细胞(AnnexinⅤ+/PI+)分别为9.1%和20.2%(P<0.01)。配比分析对照组细胞和凋亡早期组、晚期组细胞的蛋白图谱,统计分析表明:对照组K562细胞可分离出1300±50个蛋白点,组内蛋白点匹配率为(88.3±2.0)%。凋亡晚期组细胞中有10个蛋白点发生了明显和稳定的质和量的改变(P<0.01),其中8个蛋白点在凋亡后表达量上调,1个蛋白点表达下调,1个蛋白点只在对照细胞内表达。结论:差异表达的蛋白可能是三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的相关蛋白。     

HaCaT细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

背景与目的： 建立HaCaT细胞蛋白质组双向电泳图谱。 材料与方法： 用含10％ 胎牛血清的RPMI1640培养液培养HaCaT细胞,胰酶消化后收集细胞,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,离心后取上清液进行第一向第电聚焦电泳和平衡,再进行第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析。 结果： 通过对HaCaT细胞蛋白提取液进行双向电泳,在 17 cm pH 3-10 L IPG胶条上可分离到(700±23)个重复性及分辨率均较好的蛋白位点,蛋白斑点的匹配率为72.2％。 结论： HaCaT细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。     

Two-Dimensional （Polyacrylamide） Gel Electrophoresis Analysis of Apoptosis Induced by Harringtonine in K562 Cells

OBJECTIVE The anti-tumor drug, harringtonine (HT), has been extensively used with satisfactory results in the treatment of acute or chronic myeloid leukemia. Previous studies have shown that the anti-tumor activity of the drug is related to induced apoptosis of tumor cells, but the molecular mechanism still remains unclear. The main purpose of this research was to analyze the protein profiles formed during HT-induced apoptosis in K562 cells and to screen the apoptotic-related proteins.METHODS Annexin V and Pi double staining was used in combination with flow cytometry to examine the early and the late stages of HT-induced apoptosis in K562 cells. In addition two-dimensional gel electrophoresis and computer-assisted image analysis were employed to separate and compare the HT-induced apoptotic proteins of the K562 cells and the controls.RESULTS When a concentration of 10 μg/ml HT was used to treat K562 cells,the percentage of the early-apoptotic cells (Annexin V /PI-) was found to be 28.3% and 18.1% at 5 and 24 h, respectively (P＜0.01), while the rate of lateapoptotic cells (Annexin V /PI ) was at a level of 9.1% and 20.2%,respectively (P＜0.01). Matching analysis of the proteome among the control group and the early- and late-apoptotic groups showed 1,300 ± 50 protein spots which were identified in the control K562 cells with a matching rate of 88.3 ± 2.0 % for the protein spots in the two treated groups. Ten protein spots showed overt and steady changes in both quality and quantity in the cells of the late-apoptotic group (P＜0.01), among which the level of expression for eight of the ten protein spots was up-regulated after apoptosis, one was down-regulated and one was merely expressed as in the control cells.CONCLUSION The proteins with differential expression might be important proteins involved in the process of apoptosis in K562 cells induced by HT.     

Fas抗体诱导的膀胱癌细胞凋亡

背景与目的：Fas是死亡因子,可以诱导细胞的凋亡性死亡,但许多表达Fas的恶性肿瘤细胞却不能进行凋亡性死亡,可能与其表达水平低下有关,为此我们研究了细胞Fas表达水平与抗Fas治疗生物学效应之间的相互关系。方法：分别将低表达Fas的膀胱癌细胞系EJ细胞进行脂质体介导的方法转染Fas基因和肿瘤坏死因子α（TNFα)处理,并用流式细胞直接免疫荧光术检测Fas的表达;单细胞电泳和流式细胞技术检测鼠抗人Fas单克隆抗体DX2 IgG1κ诱导转染Fas基因的、经TNFα处理的和未转染未处理的EJ细胞的细胞DNA损伤和凋亡。结果：流式细胞直接免疫荧光术检测EJ细胞Fas表达阳性率19．18％,经TNFα处理后的EJ细胞Fas表达阳性率28．03％,转染Fas基因后的EJ细胞Fas分子表达阳性率68．69％。鼠抗人Fas单克隆抗体DX2 IgG1κ诱导的EJ细胞组细胞电泳后所产生的拖尾现象轻微;DX2 IgG1κ对TNFα处理组的拖尾现象明显,而对转Fas基因组可引起最强的细胞拖尾现象,经统计学分析后表明,3组细胞的尾长与总长的比值之间差异均有显著统计学意义,P＜0．01;流式细胞技术检测EJ细胞和转Fas基因组EJ细胞中的凋亡细胞分别为7．4％和66．3％。结论：EJ细胞系对Fas抗体触发细胞凋亡的敏感性依赖于细胞表面Fas的表达水平。     

生长抑素受体亚型在人鼻咽癌细胞株CNE2中表达

背景与目的：生长抑素受体（somatostatin receptor SSTR）在许多肿瘤组织均有表达，为生长抑素类似物如奥曲肽用于这些肿瘤的治疗提供了生物学基础，但对生长抑素受体在鼻咽癌中表达情况的研究甚少。本研究旨在了解生长抑素受体基因在鼻咽癌细胞中的表达情况，为生长抑素类似物用于鼻咽癌治疗的进一步研究提供试验基础。方法：采用RT—PCR法和SP免疫组化法联合检测体外培养的人鼻咽癌细胞株CNE2的SSTRs表达，并对PCR mRNA产物测序以鉴定结果。结果：RT—PCR提示人鼻咽癌细胞株CNE2分别表达生长抑素受体亚型SSTR1、SSTR2、SSTR4；免疫组化结果：人鼻咽癌细胞株CNE2表达SSTR1、SSTR2A为强阳性（〉60％），表达SSTR4为弱阳性、SSTR2介于两者之间、SSTR3和SSTR5则无表达。结论：我们的研究证实人鼻咽癌细胞株CNE2有多种生长抑素受体亚型基因表达，且以表达SSTR1、SSTR2较多。     

Two-dimensional differential gel electrophoresis/analysis of diethylnitrosamine induced rat hepatocellular carcinoma

Diethylnitrosamine (DEN) is a known carcinogen that can alkylate DNA molecules. In rats, DEN-induced hepatocellular carcinoma (HCC) model is well established. In this study, we used a two-dimensional differential gel electrophoresis (2D-DIGE) system and liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry to identify the differential expression protein profiles between the DEN-induced HCC and healthy liver cells. Western blotting and semiquantitative RT-PCR were used to further confirm the results. Seventeen differentially expressed spots were identified in DEN-induced HCC cells. Among all, the most prominent upregulated proteins include the members of the glutathione S-transferase super family, aldo-keto reductase superfamily and proteins involved in the response to oxidative stress. Downregulation was observed in 2 proteins that were known to contribute to hepatic dysfunction. This study provides the first comprehensive protein profiling of the DEN-induced HCC in rats. This model simulates the differential protein expression of human HCC and may be useful for further understanding the mechanism of HCC tumorigenesis.     

人乳铁蛋白对鼻咽癌细胞增殖的影响

目的：探讨重组人乳铁蛋白（hLF）对体外培养的鼻咽癌细胞生长特性的影响。方法：MTT法评价hLF对人鼻咽癌细胞CNE、人肝脏细胞L02的生长抑制作用。结果：乳铁蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE的增殖有抑制作用并呈现剂量依赖眭,对正常细胞无抑制作用。结论：人乳铁蛋白可以抑制鼻咽癌细胞CNE的增殖。     

人乳铁蛋白对鼻咽癌细胞增殖的影响

目的:探讨重组人乳铁蛋白(hLF)对体外培养的鼻咽癌细胞生长特性的影响.方法:MTT法评价hLF对人鼻咽癌细胞CNE、人肝脏细胞L02的生长抑制作用.结果:乳铁蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE的增殖有抑制作用并呈现剂量依赖性,对正常细胞无抑制作用.结论:人乳铁蛋白可以抑制鼻咽癌细胞CNE的增殖.     

人肺鳞癌组织及癌旁组织蛋白质双向电泳图谱的差异分析

背景与目的:肺鳞癌的发生发展是一个多因素、多步骤的过程,虽然从基因和转录水平已对肺癌进行了许多成功的研究,但其癌变机制仍不十分明确,目前尚缺乏有效的用于肺鳞癌早期诊断和预后监测的特异性分子标志物。本研究的目的是利用蛋白质组学方法,建立分辨率高和重复性好的人肺鳞癌组织及其癌旁正常支气管上皮组织的双向凝胶电泳图谱,并识别鉴定其差异表达的蛋白质。方法:利用固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)双向凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE),分离人肺鳞癌组织及癌旁正常支气管上皮组织的总蛋白质,用图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质;应用质谱仪(massspectrometry)得到相应的肽质指纹图谱(peptidemassfingerprint,PMF),然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果:(1)建立双向凝胶电泳图谱:癌组织和癌旁正常支气管上皮组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为1349±67和1297±73,平均匹配的点数分别为1235±48和1183±56,匹配率达91.5%和91.2%;同一癌组织的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)方向的偏差是(0.873±0.125)mm,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE方向上的偏差为(1.025±0.213)mm。(2)肽质指