日本血吸虫PcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗的构建及其对家兔保护性免疫作用的研究

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白抗原的部分基因序列，构建日本血吸虫pcDNA3．1( )／MLP核酸疫苗(SJP)，免疫新西兰家兔，观察它在肌肉组织中的表达、及其对家兔的保护性免疫作用。方法 分子克隆常规操作构建SJP疫苗，免疫家兔，家兔肌肉组织体外扩增查MLP基因，并通过免疫组化观察重组蛋白在局部肌组织中的表达：做血清抗体及细胞因子分析，计算减虫率及减卵率。结果 经酶切、PCR及测序鉴定表明所构建的SJP中含有目的基因序列；免疫家兔8周后可以在免疫家兔肌肉中检测到MLP基因，免疫组化结果阳性；可诱导IgA、IgGl及INF-γ变化，减虫率为24．10％，减卵率为28．10％。结论 成功地构建了含目的基因的核酸疫苗SJP，SJP免疫家兔后，肌组织有重组蛋白的表达，并可产生一定的免疫保护性作用。     

日本血吸虫编码基因pcDNA3／SjHGPRT核酸疫苗在免疫宿主体内分布的观察

目的观察日本血吸虫候选核酸疫苗pcDNA3／sjHGPRT肌肉注射后在小鼠体内的组织分布。方法将昆明小鼠随机分为3组：生理盐水对照组和pcDNA3对照组和pcDNA3／sjHGPRT实验组,实验组免疫接种剂量为150μg,各组于免疫接种后12h、1、3、6周分批处死,留取全血、心、肝、脾、肺、肾及注射部位肌肉,提取各组织总DNA,PCR法检测pcDNA3／SjHGPRT的分布。结果接种后12h即可在小鼠血液、心、肝、脾、肺、肾组织及注射部位肌肉中检测到质粒分布,接种后3周仍可在注射部位肌肉组织及个别脏器组织中检测出,至接种后6周不再检出。结论肌肉注射pcDNA3／SjHGPRT后,可在组织中广泛分布,持续分布时间为接种后3周,随后质粒DNA不再被检出,证明其与小鼠基因组DNA整合的可能性极小。     

日本血吸虫SjC21.7核酸疫苗诱导小鼠保护性免疫作用的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 1.7k Da膜蛋白分子 (Sj C2 1.7)核酸疫苗对 BAL B/ c小鼠的免疫保护性作用。　方法　采用 PCR方法扩增出特异性 Sj C2 1.7基因的开放阅读框序列 ,在其起始密码子处引入 Kozark序列。将目的基因片段亚克隆到真核表达质粒 pc DNA3.1中 ,构建重组真核表达质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1。 4 8只 BAL B/ c小鼠分为对照组、实验组和加强组。对照组小鼠的股四头肌注射接种 pc DNA3.1,实验组同法注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc D-NA3.1,加强组除注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1外 ,同时注射重组质粒 P35 - pc DNA3.1及 P4 0 - pc DNA。每隔 2 wk免疫 1次 ,共免疫 3次。第 3次免疫后第 30天 ,每只鼠感染 4 5± 1条尾蚴 ,4 5 d后剖杀计数各组小鼠成虫数及肝卵数。通过 EL ISA和免疫组化分析观察小鼠免疫学特征的变化。　结果　免疫组化分析显示 ,实验组小鼠股四头肌局部组织有特异性抗原蛋白表达。EL ISA分析表明 ,免疫后实验组和加强组有部分小鼠出现特异性 Ig G抗体。与对照组比较 ,实验组减虫率及减卵率分别为 2 9.9%及 13.8% ,加强组分别为 31.9%及 2 8.0 %。加强组减卵率显著高于实验组(P<0 .0 5 )。　结论　 Sj C2 1.7核酸疫苗能诱导 BAL B/ c小鼠产生一定水平的抗血吸虫感染     

日本血吸虫体表蛋白Tetraspanin 2-A核酸疫苗的构建及其对小鼠的免疫试验

采用PCR法扩增日本血吸虫体表四跨膜家族蛋白2-A（SjTsp2-A）基因,构建重组质粒pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A,将其转至大肠埃希菌DH5α制备DNA疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A。24只BALB/c小鼠均分3组,每鼠于左股四头肌注射0.5 mg/ml盐酸布比卡因50 μl。次日,A组同法注射DNA疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A,B组注射重组质粒pcDNA3.1（+）/SjGST,C组注射空质粒pcDNA3.1（+）。注射剂量均为100 μg/只。每隔2周注射1次,共3次,末次免疫后2周各组均经腹部皮下感染日本血吸虫尾蚴40±2条/鼠,45 d后剖杀,计数减虫率和减卵率。ELISA检测抗体效价,A组化分析股四头肌局部组织蛋白表达情况。结果A组的平均检虫数和每克肝组织虫卵数均显著低于B组和C组（P值均<0.05）,A组的减虫率和减卵率分别为44.4%和28.4%。A组血清抗体效价高达1 ∶ 25 600。A、B两组局部组织均有特异性蛋白表达。DNA候选疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A能诱导小鼠产生一定的免疫保护作用。     

日本血吸虫核酸疫苗与基因克隆的研究

日本血吸虫疫苗的发展经历了减毒活疫苗、基因重组抗原疫苗和核酸疫苗等阶段.核酸疫苗,即把外源基因克隆到真核质粒表达载体上,然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内,使外源基因在活体内表达,产生抗原激发机体的免疫系统,引发免疫反应[1].此外,核酸疫苗具有亚单位疫苗的完全性和减毒活疫苗诱导全面免疫反应的高效性[2].核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,目前研究较多的是DNA疫苗[3].本文谨此进行总结.     

日本血吸虫病核酸疫苗研究进展

血吸虫病是严重危害人类健康的寄生虫病,寻找新的杀虫药物和开发研制有效抗血吸虫疫苗已成为刻不容缓的工作。随着现代分子生物学及免疫学的发展,血吸虫病疫苗已由减毒活疫苗、基因重组抗原疫苗发展到核酸疫苗等阶段[1-2]。疫苗是20世纪最重要的公共卫生成就之一[3]。传统的疫苗研究策略是模拟自然感染,成功的疫苗多依赖于中和抗体的产生;虽然减毒活疫苗的免疫保护作用效果显著,但缺乏足够的虫源,且多种抗原成分不一定全部产生保护力,甚至可能导致免疫性病变或免疫抑制。基因重组抗原疫苗应用安全,但只能引起体液免疫,且蛋白的提取纯化步骤…     

日本血吸虫SjC23蛋白质疫苗对核酸疫苗免疫增强作用的研究

目的　研究 Sj C2 3蛋白质疫苗对 Sj C2 3DNA疫苗增强小鼠的免疫保护作用的效果。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和 Sj C2 3大亲水片段融合蛋白质 (GST-HD)疫苗。把 48只 BAL B/ c小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (DNA和蛋白质疫苗联合免疫组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白质疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射 5 0 μgGST- HD+5 0 μg CFA1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0 μg pc DNA3.1。各组在末次免疫后 4周每鼠以 45± 2条日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 42 .9%的减虫率和 6 0 .0 %的减卵率 ,均显著高于单独Sj C2 3DNA疫苗组 2 8.1%的减虫率和 37.9%的减卵率 ,及单独蛋白质疫苗组 (GST- HD) 2 3.8%减虫率和 39.5 %的减卵率 (P均 <0 .0 5 )。联合组抗体水平     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫力的研究

目的构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)重组质粒,并观察其在小鼠体内诱导的抗日本血吸虫感染保护作用。方法RT-PCR特异性扩增Sj14FABP基因,将其克隆入真核表达载体pVIVO2,通过PCR、双酶切及测序鉴定。获得的重组质粒pVIVO2-Sj14FABP转染HepG2细胞,间接免疫荧光(IFA)检测蛋白表达;并免疫BALB/c小鼠,30d后攻击感染,感染后45天剖杀,计数检获成虫数和肝脏虫卵数。结果RT-PCR扩增出大小为440bp的Sj14FABP片段,重组质粒经PCR和双酶切后均获得目的片段,转染细胞IFA结果显示有较强荧光。重组质粒免疫小鼠后分别获得24.1%减虫率和27.2%减卵率。结论成功构建和表达重组质粒pVIVO2-Sj14FABP,该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

提高血吸虫疫苗保护性效果的研究进展

对血吸虫感染产生的特异性免疫应答表现为非消除性免疫。当前，血吸虫疫苗的研究仍是世界性难题。迄今为止，还没有一种理想的疫苗可用于免疫预防以阻断血吸虫病的传播。基于国内外学者近几年在血吸虫病疫苗研究领域中取得的成就，本文在核酸疫苗、甘露糖化抗原、鸡尾酒式疫苗、免疫佐剂选用及改变免疫微环境等方面，就如何提高血吸虫病疫苗保护效果作一综述。     

日本血吸虫肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗的构建与小鼠保护性研究

目的研究日本血吸虫肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗对小鼠的保护效果。方法用致弱童虫免疫血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,获得的阳性克隆之一与曼氏血吸虫肌球蛋白重链基因同源。PCR法扩增该片断基因,产物克隆入真核表达载体pcDNA3中,构建成肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗。将50μg肌球蛋白(myosin)核酸疫苗注射C57BL/6小鼠的两侧股四头肌,免疫3次,间隔2周,末次免疫后2周经腹部皮肤攻击感染尾蚴30条/鼠,感染6周后用门静脉灌注法收集成虫,计算核酸疫苗免疫组减虫率与空质粒对照组减虫率。结果核酸疫苗免疫组获得了33.02%的减虫率,空质粒对照组获得了24.50%的减虫率,经t检验,两组差异无显著性。结论肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗在小鼠中未能诱导出保护力。     

日本血吸虫卵黄铁蛋白DNA免疫在小鼠诱生的保护性免疫力

目的：研究日本血吸虫卵黄铁蛋白基因DNA免疫小鼠诱生的保护性免疫力。方法：分两大组进行,实验I小鼠有预感染,实验II小鼠没有。将构建的日本血吸虫卵黄铁蛋白基因真核表达重组质粒pL－SjFerl经左右腿肌肉注射BALB／c小鼠,共免疫2次,间隔2周。末次免疫后5w以血吸虫尾蚴攻击感染,6w后计数成虫负荷及肝组织虫卵数和死亡卵百分比。设空质粒免疫组为对照组。结果：PL－SjFerl免疫小鼠,在实验I主要诱生IgG1和IgG3,在实验II主要诱生IgG2a和IgG2b;实验组尚产生较高水平的IgA和IFN-γ应答。pL－SjFerl免疫小鼠诱生一定程度的减虫率（26.47％,34.08％）,减卵率（40.02％,36.83％）和死亡卵百分比（27.50％,30.13％）。结论：PL－SjFerl免疫小鼠能产生较明显的保护性免疫力,值得进一步深入研究。     

日本血吸虫副肌球蛋白全基因核酸疫苗在小鼠诱生的保护性免疫力

目的： 研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白全基因核酸疫苗免疫Ｃ５７ ＢＬ／６ 及ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠诱生的保护性免疫力。方法： 将构建的日本血吸虫大陆株副肌球蛋白全基因核酸疫苗 （ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７） 经后腿胫前肌免疫Ｃ５７ＢＬ／６及ＢＡＬＢ／ｃ小鼠, 共免疫３ 次, 每次间隔３ ｗ ｋ。末次免疫后３ ｗ ｋ 以血吸虫尾蚴攻击感染, ６ ｗｋ 后计数成虫负荷及肝、脾、肠组织虫卵数。设不含ＳｊＣ９７ 编码基因的空载体质粒免疫组为对照组。结果： ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７ 免疫Ｃ５７ ＢＬ／６ 小鼠主要诱生ＩｇＧ２ａ 和ＩｇＧ２ｂ 亚类, 而免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠除诱生ＩｇＧ２ａ 和ＩｇＧ２ｂ 亚类外, 还诱生ＩｇＧ１。ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７ 免疫Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠诱生较明显的减虫率 （３５．５％ ～４１．１％ ） 和减卵率 （肝、脾及肠组织减卵率分别为４４．５％ ～５９．６％ 、５６．７％ ～８２．４％ 及５７．９％ ）, 而对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠未诱生保护性。结论： ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７ 核酸疫苗能对Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠诱生较明显保护性免疫力, 而对ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠未诱生免疫保护力     

日本血吸虫卵黄铁蛋白基因免疫小鼠的保护性研究

目的 研究日本血吸虫卵黄铁蛋白基因DNA免疫小鼠诱导的保护性免疫力。方法 将构建的日本血吸虫卵黄铁蛋白基因真核表达重组质粒pLXSN-Fer l经左右腿肌肉注射BALB/c小鼠,共免疫2次,间隔2周。末次免疫后5周以血吸虫尾蚴攻击感染,攻击感染后6周计数成虫负荷及肝组织虫卵数和死亡卵百分比。设空质粒免疫组为对照组。结果 pLXSN-Fer l免疫小鼠,诱生的IgG亚类主要是IgG2a和IgG2b;免疫组可产生较高水平的IgA和IFN-γ应答。pLXSN-Fer l免疫小鼠诱生一定程度的减虫率34.08%,减卵率36.33%,死亡卵百分比为30.13%。结论 pLXSN-Fer l免疫小鼠能产生较明显的保护性免疫力,值得进一步深入研究。     

日本血吸虫重组抗原保护性免疫力的诱导

采用日本血吸虫重组抗原加福氏佐剂免疫小鼠,攻击感染后,不仅可减少虫负荷(减虫率为29.2％—51.0％),还可降低血吸虫雌虫的产卵量(减卵率为52.1％—74.3％),抗体滴度在初次免疫后3wk即显著升高,并持续维持较高水平。结果表明,经大肠杆菌表达的日本血吸虫重组抗原能够诱导抗攻击感染的保护性免疫力,可望作为混合多价疫苗的候选组分。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjC FABP)核酸疫苗诱导小鼠免疫保护作用研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白分子 (Sj C FABP)核酸疫苗对 BALB/c小鼠的免疫保护性作用。方法　根据 Sj C2 1.7分子基因序列合成 1对特异性引物 P1和 P2 ,并使其5’端分别带有 Bam H1、Xho1的酶切位点序列 ,采用 PCR方法从重组质粒 Sj C FABP-p UC19中扩增出特异性目的基因的开放阅读框序列 ,并在其翻译起始密码子处引入 Kozark序列。限制性酶切后的基因片段被亚克隆到真核表达质粒 pc DNA3 .1中 ,构建成重组真核表达质粒 Sj C FABP-pc D-NA3 .1,大量制备纯化的重组真核表达质粒。 48只 BAL B/c小鼠分为对照组、实验组、加强组。对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 0μg质粒 pc DNA3 .1DNA,实验组以同样的方式注射 10 0μg重组质粒 Sj C FABP-pc DNA3 .1DNA,加强组除注射 10 0μg重组质粒 Sj C FABP-PCDNA3 .1DNA外 ,同时注射 P3 5 -pc DNA3 .1,P40 -pc DNA重组质粒各 10 0μg。每隔 2周免疫 1次 ,共免疫3次。第 3次免疫后的第 3 0天每只小鼠经腹部皮肤感染 (4 5± 1)条尾蚴 ,45 d后剖杀 ,计数各组小鼠肝虫卵数及成虫数。于免疫前及末次免疫后 2周分别经尾静脉采血 ,测定抗体水平。在第 2次免疫后第 10天各组取 2只小鼠处死 ,取股四头肌进行免疫组化分析。结果　免疫组化分析显示实     

日本血吸虫31kDa组织蛋白酶B DNA疫苗保护性免疫效果观察

目的观察日本血吸虫31kDa组织蛋白酶BDNA疫苗(Sj31B1N)在小鼠体内的保护性免疫效果.方法用Sj31B1N和Sj31B1N+pUCDNA疫苗肌注免疫BALB/C小鼠,用空白质粒载体VR1012做对照,在0、4、8周共免疫3次,每次免疫前及末次免疫后4周从尾静脉采血收集血清,经ELISA法检测小鼠血清抗体升高时,用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠.结果Sj31B1N和Sj31B1N+pUC减虫率分别为24.2%和22.0%;肝卵减少率分别为34.9%和39.5%,每雌肝卵减少率分别为30.4%和35.3%.结论小鼠接种Sj31B1N后对日本血吸虫感染有减虫、减卵作用及抗雌虫生殖的作用.加质粒佐剂pUC未见有增强免疫效果的作用.     

旋毛虫感染母鼠产小鼠抗血吸虫感染保护性的初步研究

目的 探讨旋毛虫感染母鼠产小鼠抗血吸虫感染的保护性效果。方法 用旋毛虫感染母鼠产子代小鼠及该小鼠血清经尾静脉和肌肉注射被动转移小白鼠，在感染血吸虫尾蚴42d后解剖检虫，检测小鼠对血吸虫感染的保护效果。结果 旋毛虫感染母鼠产小鼠减虫率为24．31％，其小鼠血清静脉和肌肉注射被动转移小白鼠减虫率分别为18．65％和20．77％。结论 旋毛虫感染母鼠产小鼠及小鼠血清静脉和肌肉注射被动转移小白鼠均可产生抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫磷酸丙糖异构酶小鼠免疫试验

目的：探讨从日本血吸虫大陆株成虫分离的天然磷酸丙糖异构酶抗原（ＳｊｃＴＰＩ）免疫小鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用。方法：采用丙酮沉淀法从日本血吸虫大陆株成虫中提取天然的ＴＰＩ抗原，并以所提纯的ＳｊｃＴＰＩ抗原加福氏佐剂经皮下和肌肉注射免疫ＮＩＨ小鼠，攻击感染后６ｗｋ收集小鼠血清并计数成虫负荷及肝、肠组织虫卵数。同时设有日本血吸虫成虫抗原（ＳＷＡＰ）免疫对照组和攻击感染对照组。结果：天然ＳｊｃＴＰＩ抗原免疫小鼠后减虫率为２１．４％－２５．０％，肝组织减卵率达５７．８％－６０．３％；ＥＬＩＳＡ法检测ＴＰＩ免疫小鼠血清抗ＴＰＩ抗体ＯＤ值明显高于对照组小鼠的ＯＤ值（Ｐ＜０．０５）。结论：天然的ＳｊｃＴＰＩ抗原具明显的免疫原性和抗原性，可以继续进行编码ＴＰＩ基因的克隆与表达。     

日本血吸虫SjCTPI和SjC23 DNA疫苗联合免疫保护作用的研究

目的　探索 Sj CTPI和 Sj C2 3DNA疫苗联合应用保护性免疫的协同作用。方法　大量制备 pc DNA3.1- Sj CTPI和 pc DNA3.1- Sj C2 3的质粒 DNA。 4 8只 BAL B/ c小鼠分为 4个组 (A、B、C、D组 )每组 12只。 A组每鼠经双侧股四头肌注射 10 0 μg pc DNA3.1的质粒 DNA,为对照组 ;B组为Sj C2 3组 ,每鼠肌注 10 0μg pc DNA3.1- Sj CTPI的质粒 DNA;C组为 Sj CTPI组 ,每鼠肌注 10 0μgpc DNA3.1- Sj CTPI的质粒 DNA;D组为联合免疫组 ,每组肌注 10 0μg pc DNA3.1- Sj C2 3和 10 0μgpc DNA3.1- Sj CTPI质粒 DNA的混和物。分别于 0、14、2 8d免疫 3次。末次免疫后 30 d,每鼠经腹部皮肤攻击感染 (45± 2 )条日本血吸虫尾蚴。攻击后 4 5 d,剖杀所有小鼠 ,灌冲 ,收集成虫并计数。每鼠肝脏称重后剪碎 ,置 5 % KOH中消化 ,并计数虫卵数。比较各组间的减虫率和减卵率。结果　与对照组相比 ,Sj C2 3组、Sj CTPI及联合组的减虫率分别为 2 8.1%、2 9.1%和 4 1.5 % ,均非常显著地高于对照组 (P分别为 <0 .0 1,<0 .0 1,<0 .0 0 1) ,而联合组则又显著地高于单独 Sj C2 3组及单独 Sj CTPI组 (P均 <0 .0 5 )。三组的减卵率分别为 37.9%、4 4 .2 %和 6 1.4 % ,均非常显著地高于对照组 (P分别为 <0 .0 1,<0 .0 1,<0 .0 0 1) ,但