重组野生型DNA聚合酶β表达载体VRl012—polβ的构建

目的：构建含有野生型DNA聚合酶β基因的重组表达载体VRl012-polβ。方法：提取胎儿食管上皮组织的总RNA,反转录成cDNA,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VRl012,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定。结果：插人片段与GenBank报道一致,并且插入方向正确。结论：重组野生型DNA聚合酶B表达载体VRl012-polβ的构建成功,为深入研究提供了工具。     

野生型DNA聚合酶β重组绿色荧光蛋白表达载体的构建

目的：构建携带野生型DNA聚合酶β基因(wtDNA polβ)的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3——polβ。方法：运用PCR方法，从质粑pcDNA3．1-polβ中扩增出wtDNA polβ的开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—T载体，再定向克隆至pEGFP—C3，重组质粒pEGFP—C3—polβ用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果与结论：多种鉴定方法让实了重组载体pEGFP—C3—polβ中的wtDNA polβ序列与GenBank中已知的序列相符。携带wtDNA polβ的重组增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3—polβ构建成功。     

野生型DNA聚合酶β在肺腺癌细胞中的表达研究

目的研究人野生型DNA聚合酶β基因编码的蛋白质在肺腺癌A549细胞株内的表达。方法将人重组的携带野生型的DNA聚合酶β基因真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-polβ用脂质体介导的方法转染A549细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,RT-PCR检测其在核酸水平的表达。结果野生型的DNA聚合酶β基因转染细胞后主要定位于细胞核内,而不含DNA聚合酶β基因的空质粒转染细胞后则主要表达在胞浆中,RT-PCR证实转染细胞中的野生型的DNA聚合酶β比未转染细胞表达量高。结论野生型的DNA聚合酶β基因在A549细胞中表达,且定位于胞核内,这对进一步研究肺癌的发生发展奠定了基础。     

DNA聚合酶β靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建DNA聚合酶β（polβ）靶向的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体。方法：根据GenBank中人DNApolβ基因（M13140）的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论：成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。     

转染野生型DNA聚合酶β对交链孢霉酚致突变作用的影响

目的:观察转染野生型DNA聚合酶β(polymerase beta,polβ)对交链孢霉酚(alternariol,AOH)致突变作用的影响.方法:用pEGFP-C3(空载体)、pEGFP-C3-polβ(野生型polβ重组表达载体)质粒转染NIH3T3细胞;转染后的细胞分别用1.5 μmol/L、2.0 μmol/L和2.5 μmol/L 3种浓度的AOH诱导48 h,RT-PCR扩增DNA polβ基因,克隆至pEGM-T载体后,转化大肠杆菌JM109,筛选鉴定,进行测序分析.结果:转染pEGFP-C3的NIH3T3细胞DNA polβ基因突变点个数随AOH浓度升高而增多,而转染pEGFP-C3-polβ的NIH3T3细胞DNA polβ基因在1.5 μmol/L和2.0 μmol/L浓度诱导下未见突变发生,当AOH浓度增大到2.5 μmol/L才出现DNA polβ基因突变.结论:高表达野生型DNA polβ能够在一定程度上抵抗霉菌毒素的致突变作用.     

含人DNA聚合酶β基因启动子萤光素酶报告载体的构建

目的:构建含人DNA聚合酶B(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.方法:利用PCR技术扩增人类polβ基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-Neo-enhancer,构建含DNA polβ启动子的萤光素酶表达载体pGLpolβ/promoter,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定.将构建的载体用脂质体转染体外培养的食管癌EC-1细胞株,应用萤光素酶测定系统检测萤光素酶的表达活性.结果:测序结果表明,克隆获得的polβ基因启动子序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确.pGL3polβ/promoter组萤光素酶的表达活性(2 207 348.000±71 626.763)与空白组(451.670±23.347)和pGL3.Neo-enhancer组(4 884.330±1 623.047)相比,差异有统计学意义(F=5 681.596,P<0.05).结论:成功构建了含人DNA polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础.方法 应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞.结果 重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段.与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功.以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中.重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6 介导转染293 包装细胞出现细胞病变效应(CPE).采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断.结论 携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

紧密连接蛋白claudin-1基因的克隆和大肠癌细胞表达载体的构建

目的 研究claudin-1在大肠癌中的作用,构建包含claudin-1基因编码区域的重组质粒.方法 从人类大肠癌细胞株SW620用Trizol提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得DNA,限制性内切酶进行酶切、T4连接酶进行连接:将PCR产物插入绿色荧光蛋白pEGFP-C1载体,然后转染进人人类大肠癌细胞株SW480.结果 重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析,显示序列正确,在SW480中主要为膜表达.结论 成功构建了claudin-1/pEGFP-C1重组质粒,并能在人类大肠癌细胞中表达.     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞。结果重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段。与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功。以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6介导转染293包装细胞出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断。结论携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果：PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论：成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。     

内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体.方法eNOS的cDNA插入pcDNA3.1(-)中,进行DNA测序、酶切鉴定;插入片段用Xbal和AflⅡ双酶切后连接到pshuttle中,并予酶切鉴定;用P1-see I和I-ceu I双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体,通过PCR鉴定.结果正确构建重组eNOS腺病毒表达系统,并被目的基因的PCR鉴定证实.结论重组腺病毒表达载体构建正确,为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础.     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定

目的:构建一个包含人皮层肌动蛋白(cortactin)反义基因的全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin,为进一步研究人皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础. 方法: Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体. 结果: RT-PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经PCR、双酶切鉴定及测序证实已将人皮层肌动蛋白基因cDNA片段正确的反向插入真核表达载体中. 结论: 成功获得反义pcDNA3.0/cortactin重组质粒.     

大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒重组体构建

目的 构建大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒介导的表达载体。方法 提取大鼠脑组织总RNA．用逆转录PCR扩增DNA多聚酶β（POLB）的编码区，与T载体连接，作DNA测序后，酶切POLB基因并连入腺病毒穿梭质粒pAdTraek-CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。酶切鉴定，重组腺病毒质粒（pAd-polb）Lipofectamine2000转染293细胞，用293细胞扩增重组腺病毒。结果 8个TA克隆中有2个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLB cDNA序列完全一致。DNA序列正确的POLB重组腺病毒质粒Ad-polb转染293细胞后，荧光显微镜下可见绿色荧光。结论 用TA克隆和AdEasy系统，成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体。     

抑制肿瘤细胞皮层肌动蛋白装配功能的重组质粒的构建和鉴定

目的:构建一个具有拮抗肌动蛋白装配功能的重组质粒EGFP-N2/CA,为观察该基因片段对于肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响。方法:通过PCR扩增获得目的片段N-WASP-CA,通过双酶切和连接将其插入荧光表达载体EGFP-N2获得重组质粒。结果:PCR扩增后获得和预期一致的特异性DNA片段,通过PCR、双酶切和测序证实该片段已正确插入表达载体。结论:成功获得重组质粒EGFP-N2/CA。     

人肝细胞生长因子β链基因的克隆及表达载体的构建

目的 构建重组人肝细胞生长因子－β（rhHGF-β)的克隆表达体系。以期进一步研究HGF基因的表达调控及HGF的生物学、医学作用。方法 从人胎肝细胞中提取总RNA,运用RT－PCR技术,对HGF－β基因转录前加工修饰,与载体重组,构建rhHGF-β的克隆,并对克隆进行限制性内切酶酶切图谱分析,对重组体中插入的外源基因进行序列分析。结果 获得了rhHGF-β完整的cDNA序列,重组体克隆的酶切结果与设计一致。结论 首次成功地构建了人肝细胞生长因子－β（rhHGF-β）的克隆表达体系。     

大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能.方法 设计针对大鼠MeCP2 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用菌落PCR法、酶切及DNA测序鉴定重组克隆.结果 重组克隆经菌落PCR及酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确.结论 两个大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用RNAi研究大鼠MeCP2功能打下了基础.     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.     

人白介素-12植物表达载体的构建

目的:构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法:采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI, SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果:双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR 扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论:成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.