雌激素受体α基因shRNAi慢病毒载体的构建与滴度测定

目的:构建雌激素受体(ER)α基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,检测病毒感染细胞的滴度.方法:针对已经筛选确定的ERα基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCsil-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生 shERα-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用shERα-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR和测序证实,成功构建ERα shRNA的慢病毒载体shERα-LV.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/mL.结论:成功构建人ERα基因RNAi慢病毒载体,为ERα在乳腺癌发生发展中的研究提供了基础.     

Construction of p100 Knock Down Stable HepG2 Cell Line with a p100 shRNA Expression Lentiviral System

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系.方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建p LKO.3G-p1001慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定.将构建好的p100 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒.运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果.结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株.慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90％以上细胞发出绿色荧光,Western blot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系.     

p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA并构建pLKO.3G-p100I慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,利用Westernblot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90%以上细胞发出绿色荧光,Westernblot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。     

PC12细胞SLC6A4基因沉默稳转细胞系的建立及SLC6A4基因沉默对缺氧PC12细胞凋亡的影响

目的 构建SLC6A4基因RNA干扰（RNAi）-短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,建立慢病毒介导沉默SLC6A4基因的PC12细胞稳转细胞系,检测SLC6A4基因沉默对缺氧诱导的细胞凋亡的影响。方法 设计合成3条针对SLC6A4基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,在293T细胞中共转染进行慢病毒包装。转染大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞,荧光显微镜观察GFP荧光,筛选最佳shRNA干扰序列,应用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR方法检测SLC6A4基因的表达,Western blot方法检测蛋白5-HTT的表达变化,流式细胞术检测沉默SLC6A4基因对缺氧诱导的PC12细胞凋亡的影响。结果 成功构建SLC6A4-shRNA慢病毒载体并转染PC12细胞,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞内SLC6A4基因和蛋白表达明显降低（P<0.01）,证实慢病毒载体能够有效沉默SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。结论 通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默PC12细胞SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。     

CYP4F3基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建

目的构建细胞色素P450(CYP)4F3基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体。方法设计并合成CYP4F3 siRNA序列,与含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pGCL载体连接产生PscsiCYP4F3慢病毒载体,PCR和测序鉴定。用PscsiCYP4F3、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染人肾上皮细胞系293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度,并以人肺腺癌A549细胞中CYP4F3mRNA表达水平确定该基因干扰的有效靶点。结果成功构建CYP4F3siRNA的慢病毒载体,并筛选出该基因的有效干扰靶点。结论成功构建人CYP4F3基因RNAi慢病毒载体,为后期研究CYP4F3基因功能奠定基础。     

慢病毒介导shRNA干扰前列腺癌PC3细胞Keap1基因表达的研究

目的：针对Keap1构建shRNA慢病毒干扰载体,并评价慢病毒介导的RNA干扰在人前列腺癌细胞PC3中的基因沉默效应。方法：利用生物信息学方法设计针对Keapl的RNAi寡聚核苷酸序列;采用慢病毒载体构建Keapl的shR-NA载体,利用大肠杆菌进行重组表达,利用293T细胞包装得到重组腺病毒;依据绿色荧光蛋白（GFP）示踪,逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法比较各靶序列的基因干扰效果。结果：筛选了所构建的4个Keapl靶向序列,以慢病毒载体构建完成对应Keapl的shR-NA质粒。通过瞬时转染筛选得到效率最佳（干扰效率达到80％）的靶序列和工作条件。结论：本研究成功构建并筛选了针对Keapl的shRNA慢病毒载体,有效抑制PC3细胞中Keapl的表达。     

CDC25B3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.方法 合成CDC25B3基因RNAi有效靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与双酶切后的pGCL-GFP载体(含有U6启动子和GFP基因)连接产生LV-shCDC25B3慢病毒载体,挑选阳性克隆经PCR和测序鉴定.用脂质体转染法将LV-shCDC25B3、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功地构建了CDC25B3 shRNA的慢病毒载体LV-shCDC25B3.浓缩病毒悬液的滴度为1×108TU/ml.结论 成功构建人CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.     

RNA干扰沉默DDX1基因的胶质瘤细胞系的建立

目的以短发夹核糖核酸(RNA)慢病毒载体建立DEAD-box解旋酶1(DDX1)基因稳定沉默的胶质母细胞瘤细胞株。方法针对DDX1基因设计2组短发夹RNA序列,退火形成的双链DNA与线性p LKO. 1-puro-e GFP质粒载体连接,构建慢病毒质粒载体,测序正确后进行慢病毒包装;将获得的重组慢病毒转染人胶质瘤U251细胞,转染细胞分为对照组和干扰组,对照组转染对照慢病毒(sh NC);干扰组转染慢病毒载体p LKO. 1-puro-e GFP-shRNA-DDX1(sh DDX1-1,sh DDX1-2)。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,进行嘌呤霉素抗性筛选;用实时定量聚合酶链式反应(PCR)、蛋白免疫印迹法检测转染后U251细胞中DDX1 mRNA及蛋白表达。结果测序证实成功构建对照组和靶向DDX1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,病毒悬液滴度均> 3×10~8TU·m L^-1。荧光显微镜下观察显示,对照组和干扰组转染效率高于85%;嘌呤霉素筛选后,干扰组sh DDX1-1、sh DDX1-2中DDX1 mRNA的抑制率分别为85. 44%和71. 66%,DDX1蛋白表达水平分别下降了99. 1%和96. 7%,均较对照组(100%)显著降低(均P <0. 01)。结论成功构建沉默DDX 1基因的胶质瘤细胞系,为研究DDX1对胶质瘤生物学行为的影响提供细胞模型。     

Livin shRNA慢病毒载体的成功构建及鉴定

目的构建携带livin基因短片段发卡RNA（livin shRNA）的慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的干扰人livin基因的有效靶序列,设计、合成靶序列的寡聚脱氧核苷酸DNA序列（OligoDNA）,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的携带U6启动子和绿色荧光蛋白的pGCL—GFP载体连接产生短片段发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果PCR鉴定与DNA测序证实合成的含livin shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论成功构建人livin shRNA慢病毒载体。     

慢病毒介导的siRNA沉默结肠癌HCT116细胞中Slug基因表达的影响

目的探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体在结肠癌HCT116细胞中的沉默效应。方法构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及Slug siRNA三组,应用qRT-PRC和Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果。结果转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05)。结论 Slug siRNA能明显沉默靶基因Slug的表达,并且可能成为潜在治疗肿瘤的新靶点。     

脂质体介导的肝细胞生长因子基因在脐静脉内皮细胞中的表达与鉴定

目的构建含肝细胞生长因子(HGF)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,观察HGF基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。方法由重组质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,应用脂质体将重组质粒pEGFP-N1-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用荧光显微镜观察、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学方法鉴定。结果经G418筛选后可形成抗性细胞克隆;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR能扩增出HGFmRNA预期的699bp片段;免疫细胞化学证实转染HGF基因的细胞有HGF蛋白的表达。结论重组质粒pEGFP-N1-HGF能够在细胞株ECV304转录、表达。     

川芎嗪注射液对血管内皮细胞DNA合成的影响

目的 :探讨川芎嗪注射液对血管内皮细胞DNA合成的影响。方法 :采用3H -TdR掺入法 ,测定经川芎嗪注射液作用后体外培养的人脐静脉血管内皮细胞的放射性强度 (CPM )值。结果 :川芎嗪注射液可显著降低血管内皮细胞的CPM值 ,且均呈剂量依赖性。结论 :川芎嗪注射液抑制肿瘤血管生成的作用可能与其抑制血管内皮细胞DNA合成有关。     

重组人可溶性血管内皮细胞

血管内皮细胞生长抑制因子（Vascular Endothelial GrowthInhibitor,VEGI）是从人脐静脉内皮细胞（HUVEC）cDNA文库筛选到的一个TNF超家族新成员。为研究重组可溶性人VEGI对新生血管形成抑制活性,检测了重组可溶性人VEGI对建株人脐静脉内皮细胞（ECV304）增殖抑制活性以及对兔角膜诱生血管、鸡胚尿囊膜（CAM）血管的抑制活性。表明可溶性人VEGI可以直接抑制ECV304内皮细胞的增殖,抑制兔角膜诱生血管、CAM血管形成。VEGI是一种新的血管内皮细胞生长抑制因子,强烈抑制新生血管形成,有望应用于肿瘤的治疗。     

腺病毒介导的TSP1f基因转移对脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响

目的探讨腺病毒介导的凝血酶敏感蛋白1（TSP1）抗血管新生衍生物（TSP1f）基因转移对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响。方法应用RTPCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增TSP1f cDNA序列构建TSP1f重组腺病毒（ADV-TSP1f）;Western blot方法检测ADV-TSP1f介导TSP1f在K562细胞中的表达;台盼蓝拒染检测经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基对ECV304细胞增殖的抑制作用。结果K562细胞经ADV-TSP1f感染可高效表达／分泌TSP1f多肽;经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基可显著抑制ECV304细胞增殖,以ADV-LacZ及PBS作对照,抑制率分别为51．6％和53．8％。结论ADV-TSP1f可显著抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖,可望成为有效的恶性肿瘤血管新生抑制剂。     

Protective effect of quercetin on the homocysteine-injured human umbilical vein vascular endothelial cell line (ECV304)

Homocysteine is responsible for the occurrence of many cardiovascular diseases for instance by injuring the vascular endothelial cells. Quercetin has many beneficial effects on the cardiovascular system, but it is unknown whether it provides protection against homocysteine-injured vascular endothelial cells. The aim of the present study was to investigate the protective effect and mechanism of quercetin on the homocysteine-injured human umbilical vein vascular endothelial cell line (ECV304) (i.e. morphology, viability and nuclear factor kappa B (NF-kappaB) expression of ECV304 injured with 1.0 mM homocysteine) by determination of lipid peroxidant and endothelium-derived factors in the cultural medium of homocysteine-injured ECV304. Quercetin at 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 microM attenuated the morphological changes and increased viability of homocysteine-injured ECV304 in a dose-dependent manner (P < 0.05 or P < 0.01 versus the homocysteine-injured group). At the same time, quercetin at 12.5, 25 and 50 microM decreased malondialdehyde level, endothelin release and NF-kappaB expression, and increased superoxide dismutase activity, nitric oxide and 6-keto-prostaglandin F1alpha releases in homocysteine-injured ECV304 (P < 0.05 or P < 0.01 versus the homocysteine-injured group). These results suggest that quercetin has a protective effect on homocysteine-injured vascular endothelial cells by antioxidant and anti-inflammatory mechanisms.     

溶血磷脂酰胆碱对ECV304细胞中血管内皮生长因子表达的影响(英文)

目的:研究溶血磷脂酰胆碱(LPC)对内皮细胞(EC)中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:在人脐静脉内皮细胞株ECV04培养基中加入不同浓度的LPC,培养不同时间,用基础酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组EC条件培养基中VEGF蛋白含量;用免疫组织化学法检测EC中VEGF蛋白及其受体的表达;用原位杂交检测VEGF信使核糖核酸(VEGF mRNA)的表达。结果:培养的ECV304能表达VEGF受体,在胞浆内呈棕色颗粒,当LPC刺激后,阳性增强。原位杂交结果显示,培养的ECV304中未见VEGF mRNA的表达,当LPC刺激后可见VEGF mRNA的高表达,在胞浆内呈棕色颗粒。ELISA结果显示LPC可使ECV304条件培养基中VEGF蛋白含量明显增加,且具有时间和剂量依赖性。结论:LPC能诱导ECV304表达高水平的VEGF。 (责任编辑 吕静)     

丙氨酰谷氨酰胺二肽对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用

目的观察丙氨酰谷氨酰胺二肽（丙谷二肽）对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法在以低氧低糖培养人脐静脉内皮细胞ECV304为细胞损伤模型的基础上,以噻唑蓝（MTT）比色法优化丙谷二肽的最佳作用浓度,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测线粒体膜电位。自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶（LDH）活性,比色法检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的浓度,RT-PCR方法检测细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、热休克蛋白70（HSP70）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA的表达。结果丙谷二肽能够使细胞在缺氧缺糖应激下存活率增加,线粒体损伤减轻,LDH分泌降低,GSH产生增加,HSP70和HIF-1α mRNA的表达增加。结论丙谷二肽对细胞缺氧缺糖损伤有明显的保护作用,这种保护作用可能与保护线粒体、维持细胞膜结构完整、上调细胞中应激基因HSP70和HIF-1α的表达有关。     

Identification of adenosine receptor subtypes expressed in the human endothelial-like ECV304 cells

Adenosine, acting through its receptors, is a potent endogenous regulator of endothelial cells. The cultured endothelial cells expressing adenosine receptors are thus important for elucidation of molecular mechanism of adenosine functions in these cell systems. Therefore, identification of adenosine receptors in the human ECV304 cell line derived from a human umbilical vein endothelial cell culture was performed. RT-PCR experiments revealed that ECV304 cells express mRNAs for A1 and A2B adenosine receptors. The expression of mRNA for A2A adenosine receptor was not in a significant level and that for A3 adenosine receptor was not detected. The binding study of ECV304 cell membrane fractions using various radiolabeled ligands for adenosine receptors indicated the presence of A1 adenosine receptors 245 fmol/mg of membrane proteins, but the specific binding for A2A and for A3 adenosine receptors were found to be negligible. The functional expression of A1 and A2B adenosine receptors in ECV304 cells was detected by assays for adenosine-3',5'-cyclic monophosphate and for extracellular signal-regulated kinase, but that of A2A adenosine receptors was not confirmed under the assay conditions employed. In conclusion, this study presented evidence for functional A1 and A2B adenosine receptors in human endothelial-like ECV304 cells, indicating that ECV304 cells can be a good model for the study of adenosine receptors, especially for A2B adenosine receptor, in endothelial cells.     

何首乌水溶性成分2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷(ST I)对内皮细胞表达VEGF的影响何首乌水溶性成分2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷(ST I)对内皮细胞表达VEGF的影响

目的研究何首乌水溶性成分2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷(ST I)对溶血磷脂酰胆碱(LPC)诱导人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法在ECV304细胞培养基中加入LPC(2.5 mg·L^-1)或LPC与ST I共孵24 h，收集各组条件培养基，用基础酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组条件培养基中VEGF蛋白含量；用原位杂交法、RT-PCR及Realtime RT-PCR法检测LPC对内皮细胞VEGF mRNA的表达及ST I的影响。结果ECV304细胞暴露于LPC后，VEGF蛋白分泌明显增加；加入ST I后VEGF蛋白含量明显降低; LPC可以使ECV304中VEGF mRNA的表达明显升高, 并使VEGF165 mRNA的表达升高；ST I可剂量依赖性地抑制VEGF165 mRNA的高表达。结论LPC能诱导ECV304细胞表达高水平的VEGF蛋白及VEGF mRNA，1×10^-5 mol·L^-1 ST I可抑制LPC的作用，降低VEGF的高表达。